Analysis of phosphate dissolving effect and optimization of acid producing capacity of coal gangue protobacteria
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摘要:
煤矸石是采煤和洗煤过程产生的固体废物，占用大量土地且严重污染环境，因此对煤矸石的综合处理和利用已刻不容缓。目前，利用微生物降解煤矸石制备矿物肥料是实现煤矸石减量化、无害化和资源化处理最具前景的技术之一。本文研究了煤矸石原生菌株嗜麦芽窄食单胞菌（SM1菌株）的解磷特性及其机制，优化了SM1菌株的产酸性能。利用高效液相色谱、X射线衍射仪（XRD）及X射线荧光光谱（XRF）分别对细菌代谢产物、溶磷前后矿渣物相组成及原矿化学组成进行分析，揭示了SM1菌株的解磷机理。正交试验结果表明，SM1菌株的最佳解磷条件为：煤矸石粒度为115 μm，pH为9，菌液浓度为2.85×1012 CFU/mL，液固质量比6∶1，处理时长为4 d，在该条件下有效磷溶出量相对于单因素条件试验的最好结果可增加约19%。最优产酸条件体系温度30 ℃、pH=8、质量浓度8 g/L的蔗糖（碳源）、1 g/L的氯化铵（氮源）、0.3 g/L的氯化镁和0.3 g/L的磷酸二氢钾（无机盐）时体系中酸含量（以H+计）增加了0.014 mol/L。高效液相色谱结果表明代谢产物中含有大量有机酸，溶磷前后矿渣的XRD结果表明菌株溶解的含磷矿相为三斜磷钙石，结合有机酸溶解三斜磷钙石的试验，进一步验证了SM1菌株的解磷机制为其代谢产物有机酸溶解了煤矸石中三斜磷钙石，优化产酸后的有效磷含量相比于正交试验结果提高了12.7%。
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关键词:
- 煤矸石 /
- 优化产酸 /
- 有效磷 /
- 有机酸 /
- 嗜麦芽窄食单胞菌(SM1菌株)
Abstract:Coal gangue is the solid waste produced in the process of coal mining and coal washing, which has been occupied a large amount of land and polluted the environment. Therefore, it’s urgent for us to deal with coal gangue and comprehensive utilize it.The preparation of mineral fertilizer by microbial degradation of coal gangue is one of the most promising technologies to realize the reduction, harmless and resource recovery of coal gangue. In this paper, the phosphorus-releasing characteristics and mechanism of stenotrophomonas maltophilia (SM1) were studied, and the acid-producing energy of SM1 strain was optimized. High performance liquid chromatography (HPLC), X-ray diffraction (XRD) and X-ray fluorescence (XRF) were used to analyze the metabolites of bacteria, the phase composition of slag before and after phosphorus dissolution, and the chemical composition of raw ore, respectively, to reveal the mechanism of phosphorus dissolution of SM1 strain. The results of orthogonal experiment show that the optimal conditions of SM1 strain are as follows: coal gangue particle size 115 μm, pH=9, bacterial liquid concentration 2.85×1012 CFU/mL, liquid-solid ratio of 6∶1, and treatment duration 4 d. Compared with the best results of single factor experiment, the effective phosphorus dissolution of SM1 strain increases by 19% under this conditions. When the optimal acid production conditions are system temperature of 30 ℃, pH=8, 8 g/L sucrose (carbon source), 1 g/L ammonium chloride (nitrogen source), 0.3 g/L magnesium chloride and 0.3 g/L potassium dihydrogen phosphate (inorganic salt), the acid content (calculated by H+) increases by 0.014mol/L. A large amount of organic acids are metabolized by the strain by HPLC, and the XRD results of the slag before and after dissolving phosphorus-containing mineral residues show that the phosphate phase degraded by the strain is monetite, combined with the experiment of organic acid dissolving monetite, the phosphorus-solubilizing mechanism of SM1 strain is further verified by the organic acid dissolving monetite from coal gangue. The content of available phosphorus after optimized acid production is 12.7% higher than that of orthogonal experiment.
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0. 引 言
煤炭在我国能源消费结构中占56.8%，而煤矸石作为煤炭开采及洗选过程产生的固体废弃物，其排放量约占煤炭产量的15%[1-2]。目前，我国煤矸石堆存量约有70万t，占工业固体废物总排放量的40%以上[3]。煤矸石的大量堆放造成土地资源浪费，同时还易造成环境污染[4-7]。针对煤矸石堆存量巨大且具有很大危害性这一现状，亟需探索一条高效、环保及节能的煤矸石利用途径。
目前煤矸石的综合利用主要涉及生产建筑材料、矿物肥料、井下回填及能源生产等领域，此外，利用煤矸石制备陶瓷、分子筛、白炭黑及水玻璃等高附加值应用方面的研究近些年来也逐渐增多[8-11]。生产建材、能源生产及制备陶瓷等高附加值材料均对煤矸石的矿物及化学成分有较高要求，这就使得煤矸石在这些领域内只能部分利用，而且其生产过程中产生的废渣继续成为固体废弃物无法快速实现煤矸石减量化、无害化利用[12- 13]。利用煤矸石生产矿物肥料是近年来的研究热点，因其能够实现煤矸石减量化、资源化利用而倍受关注。
煤矸石制备矿物肥料的方法主要分为化学法与生物法2种[14]。化学法因其制备工艺简单、较易实现工业化已有较为成熟的生产技术。王生全等[15]采用高温煅烧活化法制备煤矸石硅肥，发现高温煅烧煤矸石可以提高煤矸石中有效硅含量；朱福英等[16]通过机械活化—高温焙烧的联合工艺生产出煤矸石硅肥，其对植物的生长和土壤的改良都有很好的促进作用。但是化学法也存在严重的缺陷，例如化学药剂的使用及焙烧过程对环境危害较大，生产过程耗能高等不可避免的问题，因此化学法无法实现煤矸石无害化利用。
生物法遵循固废的自然降解规律，活化过程不存在耗能高及危害环境等缺点，且其符合无害化、资源化及减量化的固废处理原则，近些年来受到相关学者广泛关注[17-18]。氮、磷及钾等元素作为植物必需的营养元素，也是肥料制备行业必测指标，在微生物制备矿物肥料中多有研究[19]。钟艳[20]及贾倩倩[21]等利用硅酸盐细菌和巨大芽孢杆菌降解煤矸石制备矿物肥料，考察了单因素条件对磷及钾转化的影响，2种细菌的存在很大程度上提高了煤矸石中有效磷及速效钾含量。目前国内对于微生物降解煤矸石制备矿物肥料中磷的增溶机理研究较少，很少有报道提及煤矸石含磷矿相中磷转化为有效磷的具体过程。笔者利用煤矸石原生菌株嗜麦芽窄食单胞菌（SM1菌株）来降解煤矸石，通过优化培养条件使该菌株产生更多的有机酸，从而使其有更好的溶磷效果，为微生物法处理煤矸石制备矿物肥料提供理论依据及技术支持。
1. 材料与方法
1.1 试验原料
煤矸石矿样取自山西某地矸石山，通过X射线荧光光谱（XRF）表征，可知煤矸石元素组成（表1）。煤矸石中全磷、全钾、全硅及有效磷、速效钾、有效硅的含量见表2。
表 1 煤矸石主要化学元素成分Table 1. The main chemical elements of coal gangue主要成分 SiO2 Al2O3 SO3 Fe2O3 K2O TiO2 CaO MgO Na2O P2O5 质量分数/% 53.32 24.32 7.87 6.76 1.69 1.05 0.46 0.45 0.39 0.10 表 2 原矿煤矸石各形态营养元素含量Table 2. Contents of various forms of nutrient elements in raw coal gangue营养元素 全磷 有效磷 全钾 速效钾 全硅 有效硅 含量/（mg·kg−1） 870 4.5 32 620 152.79 44 815 181.2 由表1可知，该煤矸石中未检测出重金属元素，因此利用此煤矸石制备矿物肥料具有可行性。分析纯CaHPO4、有机酸（包括草酸、酒石酸、苹果酸、甲酸及乙酸）、蔗糖、葡萄糖、硫酸铵、尿素、氯化镁及磷酸二氢钾购于天津科密欧化学试剂有限公司，可溶性淀粉及氯化铵购于天津市红岩试剂厂。
试验过程所用细菌分离自试验原料煤矸石中，其中一株具有较好解磷效果的菌株被用来试验研究，参照《伯杰氏系统细菌学手册》[22]鉴定该菌株为嗜麦芽窄食单胞菌（SM1菌株）。
1.2 试验方法
1）菌液制备：将在LB（Luria-Bertani）固体培养基培养2 d的细菌菌落在超净工作台中用接种环刮入9 mL无菌生理盐水中，摇晃使其分散均匀。通过控制刮菌量来改变菌液浓度。
2）产酸优化培养基的制备：将不同量的碳源（蔗糖、葡萄糖及可溶性淀粉）、氮源（硫酸铵、尿素、氯化铵）及无机盐溶解于无菌蒸馏水中配成培养基。
3）LB固体培养基的制备：取胰蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化钠10 g，琼脂15 g加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，调节pH为7.2，分装于锥形瓶中并在灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。
4）LB液体培养基的制备：取胰蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化钠10 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，调节pH为7.2，分装于锥形瓶中并在灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。
1.3 检测方法
1）菌液浓度的测定：将在LB固体培养基培养2 d的细菌菌落刮入无菌生理盐水中摇晃使其分散均匀，在紫外分光光度计上于波长600 nm处通过比浊法[23]测定菌液浓度。
2）有效磷的检测：将2.5 g烘干待测样用50 mL的NaHCO3（0.5 mol/L）浸提剂在30 ℃、165 r/min的条件下连续震荡浸提30 min后将样品倒入离心管10 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，通过钼锑抗比色法[24]测定待测样中有效磷含量。
3）微生物代谢产酸的测定：取样品0.5 g（精确值0.000 1 g），用去离子水定容至5 mL，用0.45 µm滤膜过滤进样，在赛默飞世尔U3000高效液相色谱-紫外检测器上对有机酸进行定量分析。测定条件为：赛默飞Hypersil GOLD C18，250 mm×4.6 mm， 5 μm色谱柱；以水（0.05 mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH=2.68）为流动相；设定淋洗程序为：0~17 min，流速0.50 mL/min；17~19 min，流速1.0 mL/min；19~25 min，流速2.0 mL/min；25~30 min，流速0.50 mL/min；进样量设为20 uL，温度为30 ℃，紫外线（UV）检测波长为210 nm。
4）煤矸石粒度：将混合均匀的煤矸石破碎后全部过筛，筛上物继续破碎直到全部过筛，不同粒度的物料分别破碎全部过筛。
2. 结果与讨论
2.1 不同处理条件对SM1菌株增溶煤矸石中有效磷的影响。
分别研究SM1菌株在不同煤矸石粒度、不同菌液浓度、不同pH、不同处理时间、不同液固比及不同处理温度的条件下对煤矸石中有效磷的增溶效果，结果如图1所示。
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图 1 不同处理条件对SM1菌株溶磷的影响Figure 1. Effects of different treatment conditions on phosphorus solubility of SM1 strain由图1可知，煤矸石粒度对SM1菌株增溶效果的影响开始时随着粒度的减小，有效磷溶出量逐渐增加，当粒度为115 μm时，有效磷有最大溶出量，之后随着粒度减小溶出量降低。由表1可知，试验用煤矸石中氧化物组成以Al2O3和SiO2为主，硅铝率（Al2O3/SiO2）为0.46，小于0.5，说明其成岩矿物主要为高岭石和石英[25- 26]。高岭石属于黏土矿物，较易风化，且粘结性较强，因此当粒度减小时，在SM1菌株的促进作用下煤矸石风化更加完全，溶出量逐渐提高，但是粒度在115 μm之后，由于粒度减小，溶液体系粘度增加，外加菌株代谢产物有机酸（表3）的作用，细粒矿物又团聚起来，使得有效磷溶出效果变差[27]。
表 3 不同pH条件下溶磷前后pH变化Table 3. pH changes before and after treatment处理前pH 3.55 6.0 7.0 8.0 9.0 处理后pH 3.32 5.70 5.08 6.04 8.06 体系pH对SM1菌株增溶效果的影响趋势表现为随着pH增高磷溶出量先增后降。对比图中调整pH和未调pH原矿（pH=3.55）有效磷溶出量可发现pH对SM1菌株的溶磷效果影响较大，在pH为7时有最好的溶出效果，其有效磷溶出量为未调pH的2.5倍（由111.34 mg/kg增高到278.36 mg/kg）。测量了不同pH条件下菌株溶磷后的体系pH值，对比溶磷前后体系pH变化情况，结果见表3。
分析表3数据可知，该菌株的存在会使体系pH降低，在接种菌液前pH=7附近SM1处理后pH降低明显，说明在该pH条件下SM1菌株产生了更多的酸性物质使得pH降低，推测酸性物质为有机酸，并且是其促进了煤矸石中磷的溶解。为了验证这一推测对其代谢产物进行检测分析，结果见表4。
表 4 SM1菌株代谢产物Table 4. Metabolites of strain SM1 mg/L产物 质量浓度 测试方法 草酸 55 HPLC液相色谱法 酒石酸 141 苹果酸 72 甲酸 550 乙酸 951 硫化氢 364 电位滴定法 二氧化碳 217 电位滴定法 氨气 69.5 离子色谱法 对表4代谢产物分析可知，SM1菌株代谢产物除了几种有机酸（草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸及甲酸）外还产生了硫化氢、二氧化碳和氨气，二氧化碳和硫化氢溶于水分别会产生碳酸和氢硫酸，说明导致体系pH降低及煤矸石中有效磷溶出的因素，除了有机酸外该菌产生的2种酸性气体也有一定作用。
处理时间对SM1菌株增溶效果的影响表现为随着处理时间的延长，溶出效果表现为先增后减的趋势，其中处理4 d效果最佳。此外处理3 d时相比于前一天溶出量增长较大，推测在处理的前期细菌处于对数期，在此阶段体系中总菌量较少，细菌产生的代谢产物较少，在3～4 d时大量细菌代谢产生的有机酸使得有效磷大量溶出。随着处理时间的延长，体系pH逐渐降低，pH的变化会引起矿物颗粒表面zeta电位的变化，当体系为酸性及接近酸性时，溶液中含有较高的H+浓度，这使得矿物颗粒表面电离出较多的OH−，矿粒会吸附较多的H+而表现为正电性[28]，因此，在处理后期会有大量的含磷的阴离子被矿物颗粒所吸附，导致溶液中可溶态磷含量下降。菌液浓度对SM1菌株增溶效果的影响较为显著，其中在菌液浓度为2.28×1012 CFU/mL时增溶效果最好，其有效磷溶出量为原矿的58倍，说明接菌量对煤矸石有效磷溶出具有较大的影响。图中液固质量比对SM1菌株增溶效果的影响表现为液固质量比为4∶1（煤矸石用量2.5 g）时有最好的溶出效果，当煤矸石用量太多时溶磷效果变差显著，如当液固质量比为2∶1及1∶1时其有效磷溶出量仅能达到液固质量比为4∶1时的21.48%及8.16%，推测是煤矸石增多使得细菌生长环境恶化，菌株的大量死亡导致了磷的增溶效果变差。温度对SM1菌株增溶效果的影响表现在30 ℃时有最佳的增溶效果。当温度较低或较高时均会影响菌株的繁殖及代谢强度，菌株的繁殖会影响系统的总菌量，而代谢强度则关系到细菌代谢产物与含磷矿物的作用强度，因此温度对菌株的增溶影响也较为关键。
通过对以上6个单因素条件试验的结果分析发现每个因素对有效磷的增溶均具有较大的影响，为了探究最佳组合和各因素的影响大小需要进行正交试验。由于温度的影响主要体现在菌株的繁殖代谢上，情况较为复杂，因此选择在30 ℃下选择其他5个因素进行正交试验。
2.2 正交试验
根据单因素条件试验设计五因素四水平正交试验，具体见表5。
表 5 正交试验方案Table 5. Orthogonal experimental scheme水平 因素 粒度/μm pH 菌液浓度/（1012 CFU·mL−1） 时间/d 液固质量比 1 180 6 1.14 2 6∶1 2 150 7 1.71 3 4∶1 3 115 8 2.28 4 3∶1 4 106 9 2.85 5 2∶1 通过设计正交试验得到16个试验组（试验1~16），试验条件及试验结果见表6。
表 6 正交试验结果Table 6. Orthogonal experimental results试验序号 粒度/μm pH 菌液浓度/（CFU·mL−1） 时间/d 液固质量比 有效磷溶出量/（mg·kg−1） 1 180 6 1.14×1012 2 6∶1 103.54 2 180 7 1.71×1012 3 4∶1 60.51 3 180 8 2.28×1012 4 3∶1 158.56 4 180 9 2.85×1012 5 2∶1 149.45 5 150 6 1.71×1012 4 2∶1 37.03 6 150 7 1.14×1012 5 3∶1 18.52 7 150 8 2.85×1012 2 4∶1 189.62 8 150 9 2.28×1012 3 6∶1 312.32 9 115 6 2.28×1012 5 4∶1 129.72 10 115 7 2.85×1012 4 6∶1 315.69 11 115 8 1.14×1012 3 2∶1 10.4 12 115 9 1.71×1012 2 3∶1 133.19 13 106 6 2.85×1012 3 3∶1 136.31 14 106 7 2.28×1012 2 2∶1 115.91 15 106 8 1.71×1012 5 6∶1 124.29 16 106 9 1.14×1012 4 4∶1 38.05 k1 118.005 101.508 42.617 135.555 213.950 — k2 139.373 127.657 88.755 129.882 104.35 — k3 147.120 120.718 178.997 137.332 111.642 — k4 103.638 158.252 197.765 105.365 78.197 — 极差R 43.482 56.744 155.148 31.967 135.753 — 表6中k1、k2、k3、k4分别代表各因素水平1、2、3、4有效磷溶出量的平均值，由此可确定SM1菌株最佳的溶磷条件为：煤矸石粒度115 μm，pH为9，菌液浓度为2.85×1012 CFU/mL，煤矸石质量1.5 g,处理4 d。通过对极差分析可知，各因素对SM1菌株溶磷效果的影响大小依次为：菌液浓度（155.148 mg/kg）>液固质量比（135.735 mg/kg）>pH（56.744 mg/kg）>粒度（43.482 mg/kg）>处理时间（31.967 mg/kg）。最后在最佳溶磷条件下进行煤矸石有效磷增溶试验，有效磷溶出量达到323 mg/kg，高于之前单因素的最高值278.36 mg/kg及正交试验中最高值315.69 mg/kg。对原矿及SM1菌株最佳条件组合溶磷后的矿渣进行XRD矿相分析，结果如图2所示。
对比溶磷前后煤矸石矿相的差异，可发现SM1菌株处理后3号峰位置所对应的三斜磷钙石强度变弱较为明显甚至消失，说明该菌株对三斜磷钙（CaHPO4）石的溶解作用较为明显。2号峰位置对应的高岭石（Al4[Si4O10](OH)8）及1号峰位置对应的铁云母（KFe3FeSi3O10(OH)2）也明显下降，说明该菌株对这2种矿相的溶解性也较强。通过对比以上几种矿相元素组成，可知煤矸石中磷元素主要以三斜磷钙石的形式赋存于其中，有效磷的增加主要是SM1菌株产生的有机酸促进了三斜磷钙石溶解所致。
2.3 有机酸溶解CaHPO4的试验探究
根据表4中不同有机酸含量，为了更贴近真实情况，分别将酒石酸、草酸及苹果酸配成20、40、60、80、100 mg/L的溶液，将甲酸及乙酸配成150、350、550 、750、950 mg/L的溶液。取0.1 g CaHPO4探究不同质量浓度下各种有机酸溶出率与溶出时间的关系，对比每种酸在相同浓度下最佳时间的溶出率，结果如图3所示。
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图 3 5种有机酸溶解CaHPO4特性分析Figure 3. Characteristic analysis of five kinds of organic acids to dissolve CaHPO4图3中草酸、酒石酸、苹果酸分别在溶解的第50、60、120 min有最高的溶出率，甲酸及乙酸最佳溶出时间相同，均在第90 min达到最大的溶出率。图3f为几种有机酸在各自最佳溶出时间下有机酸浓度对磷元素溶出率的影响，从图中整体趋势可发现酒石酸具有最好的溶出效果，其次为甲酸及乙酸，苹果酸溶出效果最差。虽然同浓度下酒石酸具有最好的溶出效果，但是SM1菌株代谢产生酒石酸的能力较小（141 mg/L），而在其代谢产物中甲酸及乙酸含量（分别951及550 mg/L）远高于其他有机酸（均低于150 mg/L）。因此可以认为SM1菌株代谢产生的几种有机酸均有溶解CaHPO4的能力，其中甲酸、乙酸及酒石酸为CaHPO4的溶解贡献较大。
2.4 溶磷机理
基于以上研究可推测SM1菌株对煤矸石中磷的溶出存在以下过程：
（1）有机酸电离：
甲酸：
$$ {\text{HCOOH}} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{{+}}}{\text{ + COO}}{{\text{H}}^{-}} $$ (1) 乙酸：
$$ {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{COOH}} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{{+}}}{\text{ + C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{CO}}{{\text{O}}^{-}} $$ (2) 酒石酸：
$$ {{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{6}}}{{\text{O}}_{\text{6}}} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{{+}}}{{ + }}{{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{5}}}{{\text{O}}_{\text{6}}}^{-} $$ (3) $$ {{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{5}}}{{\text{O}}_{\text{6}}}^{-} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{{+}}}{\text{ + }}{{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{4}}}{{\text{O}}_{\text{6}}}^{2{-}} $$ (4) 苹果酸：
$$ {{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{6}}}{{\text{O}}_{\text{5}}} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{{+}}}{\text{ + }}{{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{5}}}{{\text{O}}_{\text{5}}}^{-} $$ (5) $$ {{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{5}}}{{\text{O}}_{\text{5}}}^{-} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{+}}{\text{ + }}{{\text{C}}_{\text{4}}}{{\text{H}}_{\text{4}}}{{\text{O}}_{\text{5}}}^{{{2 - }}} $$ (6) 草酸：
$$ {{\text{H}}_{\text{2}}}{{\text{C}}_{\text{2}}}{{\text{O}}_{\text{4}}} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{+}}{\text{ + H}}{{\text{C}}_{\text{2}}}{{\text{O}}_{\text{4}}}^{-} $$ (7) $$ {\text{H}}{{\text{C}}_{\text{2}}}{{\text{O}}_{\text{4}}}^{-} \rightleftharpoons {{\text{H}}^{+}}{+}{{\text{C}}_{\text{2}}}{{\text{O}}_{\text{4}}}^{{{2 - }}} $$ (8) （2）CaHPO4溶解：
$$ {{\text{H}}^{+}}{\text{ + CaHP}}{{\text{O}}_{{\text{4(s)}}}} \rightleftharpoons {\text{C}}{{\text{a}}^{{{2 + }}}}{\text{ + }}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{P}}{{\text{O}}_{\text{4}}}^{-} $$ (9) 通过以上分析首先可以确定SM1菌株对于煤矸石中的磷有明显的促溶作用，其次对于其促溶机理可以确定SM1菌株产生的有机酸是其溶解的关键所在。
2.5 细菌的产酸优化
确定了有机酸的溶解作用，为了提高SM1菌株的产酸性能，需要优化SM1菌株的培养基配方及生长环境。改变温度、pH、碳源、氮源、无机盐的条件参数，以可滴定酸度为代谢产生总酸指标来进行SM1菌株的产酸优化。
2.5.1 培养条件温度及pH的优化
探索最佳产酸温度时，吸取1 mL 2.28×1011 CFU/mL菌液接种于150 mL pH为8.2的LB液体培养基，在30、35、40、45 ℃环境中培养，每12 h用0.01mol/L的NaOH溶液滴定H+浓度。探索最佳产酸pH时，培养基与接菌量与温度探索时保持一致。30℃下在pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0体系中培养，每隔12 h测H+浓度。滴定结果如图4所示。
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图 4 SM1菌株产酸温度及pH探索Figure 4. Exploration of acid production temperature and pH of SM1 strain由图4可知温度对SM1菌株代谢产酸的影响较为显著，总体趋势来看温度在25 ℃至30 ℃范围内H+浓度较高，说明在此温度区间内细菌代谢旺盛。改变pH对菌株产酸的影响较大，在pH为7～8时有较高的H+浓度，在弱碱性环境中该菌株也有较高的产酸量，说明该菌株在弱碱胁迫下可通过代谢产酸来改善体系环境从而维持自身生命活动。综合来看，尽管在pH为7.0及8.0时均有最高的H+浓度，但是pH为8.0时体系最终能够保持更高的H+浓度，因此最佳pH为8.0。
2.5.2 优化碳源
以葡萄糖、可溶性淀粉及蔗糖为碳源，控制氮源为1.2 g/L的氯化铵，无机盐为0.3 g/L的氯化镁和磷酸氢二钾，分别控制各种碳源为2、4、6、8、10 g/L在pH为8.0，温度控制在30 ℃体系中培养，每12 h用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定H+浓度，滴定结果如图5所示。
图5a、5b、5c分别展示了不同浓度葡萄糖、蔗糖及可溶性淀粉对SM1菌株产酸的影响，可知每种碳源质量浓度为8 g/L时SM1菌株具有最高的滴定酸量，且相比于其他培养时间段在培养的第32 h及第60 h SM1菌株有较大的产酸量，推测这2个时间点为菌株生长代谢的旺盛期，体系菌量急速增高导致产酸明显。图5d为3种碳源分别在各自最佳浓度下的产酸量对比，可知SM1利用不同碳源产酸效果从大到小依次为：蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉，分析3种碳源的结构，其中可溶性淀粉的分子量远远大于其他2种，而蔗糖及可溶性淀粉均可以水解为葡萄糖，由于蔗糖效果最好，淀粉效果最差说明该菌株对于大分子量的淀粉难以利用。蔗糖相对于葡萄糖效果更好的原因在于蔗糖更有利于菌株的生长，因此其在被SM1菌株吸收代谢过程中产生了更多的酸[29]。结合培养过程中有浓烈的酒精气味产生，推测碳源在生物体内的代谢过程如下。
可溶性淀粉：
$$ \left({\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{10}}{\text{O}}_{\text{5}}\right){n+ }\left({n/2}\right){\text{H}}_{\text{2}}\text{O}\stackrel{淀粉酶}{\to }\left({n/2}\right){\text{C}}_{\text{12}}{\text{H}}_{\text{22}}{\text{O}}_{\text{11}} $$ (10) $$ \left( {{{n/2}}} \right){{\text{C}}_{{\text{12}}}}{{\text{H}}_{{\text{22}}}}{{\text{O}}_{{\text{11}}}}{\text{ + }}\left( {{{n/2}}} \right){{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O}} \to {{\text{C}}_{\text{6}}}{{\text{H}}_{{\text{12}}}}{{\text{O}}_{\text{6}}} $$ (11) $$ {\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{12}}{\text{O}}_{\text{6}}\stackrel{酒化酶}{\to }{\text{CH}}_{\text{2}}{\text{CH}}_{\text{3}}{\text{OH+2CO}}_{\text{2}}{}^{-} $$ (12) $$ {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{OH + }}{{\text{O}}_{\text{2}}} \to {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{COOH}} $$ (13) 蔗糖：
$$ \begin{split} &{\text{C}}_{\text{12}}{\text{H}}_{\text{22}}{\text{O}}_{\text{11}}{\text{+H}}_{\text{2}}\text{O}\stackrel{蔗糖酶}{\to }{\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{12}}{\text{O}}_{\text{6}}（果糖）+\\ &\qquad{\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{12}}{\text{O}}_{\text{6}}（葡萄糖） \end{split} $$ (14) $$ {\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{12}}{\text{O}}_{\text{6}}\stackrel{酒化酶}{\to }{\text{CH}}_{\text{2}}{\text{CH}}_{\text{3}}{\text{OH +2CO}}_{\text{2}}\uparrow $$ (15) $$ {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{OH + }}{{\text{O}}_{\text{2}}} \to {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{COOH}} $$ (16) 葡萄糖：
$$ {\text{C}}_{\text{6}}{\text{H}}_{\text{12}}{\text{O}}_{\text{6}}\stackrel{酒化酶}{\to }{\text{2CH}}_{\text{2}}{\text{CH}}_{\text{3}}{\text{OH +2CO}}_{\text{2}}\uparrow $$ (17) $$ {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{OH + }}{{\text{O}}_{\text{2}}} \to {\text{C}}{{\text{H}}_{\text{3}}}{\text{COOH}} $$ (18) 因此可以认为优化碳源所产生的有机酸主要为乙酸，这与之前菌株代谢产物有机酸的高效液相色谱检测结果相对应。
2.5.3 优化氮源
以尿素、氯化铵及硫酸铵为氮源，控制碳源为8 g/L的蔗糖、无机盐为0.3 g/L的氯化镁和磷酸二氢钾分别控制各种氮源为0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 g/L在pH为8.0，温度控制在30℃体系中培养，每12 h用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定H+浓度。滴定结果如图6所示。
图6a、6b、6c分别为不同浓度的氯化铵、尿素及硫酸铵3种氮源对SM1菌株产酸的影响，可知氯化铵及硫酸铵的质量浓度控制在1.0 g/L、尿素浓度控制在2.0 g/L时各自体系中有最高的可滴定H+浓度。对于硫酸铵及氯化铵在培养的96 h之内H+浓度呈上升趋势，而尿素在24 h达到最大值后H+浓度迅速下降，说明在以尿素为氮源时菌株并不能很好的分解吸收尿素[30]，导致其在第一次繁殖期无法大量繁殖，之后菌株逐渐死亡，造成了产酸下降。图6d为3种氮源在其最佳浓度下SM1菌株的产酸对比，发现SM1菌株在3种氮源中的产酸量从大到小依次为：氯化铵＞硫酸铵＞尿素。尿素与其他两种氮源中的氮的不同在于其是有机态的氮，而细菌吸收尿素需要脲酶的参与，推测SM1菌株由于缺乏脲酶导致其无法利用尿素生长繁殖[31]。剩余2种氮以NH4+形态存在，在细菌代谢过程中存在如下转化：
$$ \mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \rightleftharpoons \mathrm{NH}_{3} \uparrow+\mathrm{H}^{+} $$ (19) 一般在生物细胞内NH4+及NH3存在一种动态平衡。由表4可知，在SM1菌株培养的过程中会释放出氨气，说明该菌株可以通过生命活动将NH3直接排出细胞，对比碳源优化组可发现氮源优化组产生了更多的H+，说明氮源优化过程中NH3直接排出细胞有利于反应正向进行，使体系中含有更多的H+。值得注意的是，NH3从细菌排出有相当一部分溶于菌液中，并且消耗了菌液中的H+，说明在氮源浓度较高时细菌代谢产生的NH3更多，消耗了大量H+使得可滴定H+浓度降低，由此可推断优化氮源理论上菌株会产生更多的H+。氮除了参与上面的反应外还会参与氨基酸的合成，因此易被细菌吸收的氮更有利于细菌的生长繁殖，细菌代谢旺盛更有利于产酸。
2.5.4 优化无机盐
以氯化镁和磷酸二氢钾为无机盐，控制碳源为8 g/L的蔗糖，氮源为1 g/L的氯化铵，在pH为8.0，温度控制在30 ℃体系中培养，每12 h用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定H+浓度，滴定结果如图7所示。
图7分别展示了磷酸二氢钾及氯化镁对SM1菌株产酸的影响。由图7可知，在其他条件不变的情况下，磷酸二氢钾质量浓度为0.7 g/L时，该体系H+浓度最高，但是结合氮源及碳源优化组分析得出，在磷酸二氢钾及氯化镁质量浓度为0.3 g/L时体系产酸量最大，因此2种无机盐离子的最佳质量浓度应控制在0.3 g/L。
综上，SM1菌株产酸量除了与菌株生长环境的温度及pH有关外，还与细菌摄取的营养物质有关，其中碳源、氮源及无机盐的种类与用量都会影响其产酸量。通过调控菌株的生长环境可以使菌株的产酸得到优化，在优化条件下进行菌株溶解煤矸石的试验，最终测得有效磷含量为354.14 mg/kg，相比于原来的最好结果323 mg/kg有所提高，因此利用微生物溶出煤矸石营养元素时优化其生长环境对浸出效果有促进作用。
3. 结 论
1)煤矸石中磷元素主要以三斜磷钙石的形态存在，原生菌株SM1具有较强的解磷能力，并且其代谢产物有机酸能够溶解煤矸石中的三斜磷钙石以提高煤矸石有效磷含量。
2) SM1菌株溶出煤矸石有效磷的最佳条件为：粒度115 μm、时间4 d、pH为9、菌液浓度2.85×1012 CFU/mL、煤矸石质量1.5 g（液固质量比6∶1）。在最佳条件下煤矸石有效磷含量达323 mg/kg。各因素对溶磷的影响大小依次为：菌液浓度>液固质量比>pH>粒度>处理时间。
3)有机酸溶解三斜磷钙石证明SM1菌株溶解煤矸石主要机制为其代谢产物有机酸的溶解作用，其中酒石酸有较好的溶出效果，但考虑到菌液中乙酸及甲酸含量相对较高，因此可认为乙酸、甲酸及酒石酸为主要的促溶成分。优化产酸试验表明在体系温度控制在30 ℃，pH控制在8左右，碳源、氮源及无机盐分别以8 g/L的蔗糖、1 g/L的氯化铵及0.3 g/L的氯化镁和0.3 g/L的磷酸二氢钾时SM1菌株有较高的产酸量。在该条件下用SM1菌溶解煤矸石中的磷，有效磷含量可达354.14 mg/kg，溶出率可达40%。
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图 1 不同处理条件对SM1菌株溶磷的影响
Figure 1. Effects of different treatment conditions on phosphorus solubility of SM1 strain
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图 3 5种有机酸溶解CaHPO4特性分析
Figure 3. Characteristic analysis of five kinds of organic acids to dissolve CaHPO4
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图 4 SM1菌株产酸温度及pH探索
Figure 4. Exploration of acid production temperature and pH of SM1 strain
表 1 煤矸石主要化学元素成分
Table 1 The main chemical elements of coal gangue
主要成分 SiO2 Al2O3 SO3 Fe2O3 K2O TiO2 CaO MgO Na2O P2O5 质量分数/% 53.32 24.32 7.87 6.76 1.69 1.05 0.46 0.45 0.39 0.10 
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表 2 原矿煤矸石各形态营养元素含量
Table 2 Contents of various forms of nutrient elements in raw coal gangue
营养元素 全磷 有效磷 全钾 速效钾 全硅 有效硅 含量/（mg·kg−1） 870 4.5 32 620 152.79 44 815 181.2
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表 3 不同pH条件下溶磷前后pH变化
Table 3 pH changes before and after treatment
处理前pH 3.55 6.0 7.0 8.0 9.0 处理后pH 3.32 5.70 5.08 6.04 8.06
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表 4 SM1菌株代谢产物
Table 4 Metabolites of strain SM1 mg/L
产物 质量浓度 测试方法 草酸 55 HPLC液相色谱法 酒石酸 141 苹果酸 72 甲酸 550 乙酸 951 硫化氢 364 电位滴定法 二氧化碳 217 电位滴定法 氨气 69.5 离子色谱法
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表 5 正交试验方案
Table 5 Orthogonal experimental scheme
水平 因素 粒度/μm pH 菌液浓度/（1012 CFU·mL−1） 时间/d 液固质量比 1 180 6 1.14 2 6∶1 2 150 7 1.71 3 4∶1 3 115 8 2.28 4 3∶1 4 106 9 2.85 5 2∶1
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表 6 正交试验结果
Table 6 Orthogonal experimental results
试验序号 粒度/μm pH 菌液浓度/（CFU·mL−1） 时间/d 液固质量比 有效磷溶出量/（mg·kg−1） 1 180 6 1.14×1012 2 6∶1 103.54 2 180 7 1.71×1012 3 4∶1 60.51 3 180 8 2.28×1012 4 3∶1 158.56 4 180 9 2.85×1012 5 2∶1 149.45 5 150 6 1.71×1012 4 2∶1 37.03 6 150 7 1.14×1012 5 3∶1 18.52 7 150 8 2.85×1012 2 4∶1 189.62 8 150 9 2.28×1012 3 6∶1 312.32 9 115 6 2.28×1012 5 4∶1 129.72 10 115 7 2.85×1012 4 6∶1 315.69 11 115 8 1.14×1012 3 2∶1 10.4 12 115 9 1.71×1012 2 3∶1 133.19 13 106 6 2.85×1012 3 3∶1 136.31 14 106 7 2.28×1012 2 2∶1 115.91 15 106 8 1.71×1012 5 6∶1 124.29 16 106 9 1.14×1012 4 4∶1 38.05 k1 118.005 101.508 42.617 135.555 213.950 — k2 139.373 127.657 88.755 129.882 104.35 — k3 147.120 120.718 178.997 137.332 111.642 — k4 103.638 158.252 197.765 105.365 78.197 — 极差R 43.482 56.744 155.148 31.967 135.753 —
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百度学术
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