Variation characteristics of substrate and flora metabolism associated with co-fermentation of coal and corn straw
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摘要:
在煤的厌氧发酵系统中加入秸秆能够显著提高煤制生物甲烷产气量，但联合发酵伴随的底物与菌群代谢的变化规律却鲜有研究。开展不同煤阶煤与玉米秸秆联合发酵生物产气试验，基于16S rRNA测试探讨菌群代谢特征，采用SEM测试分析煤与玉米秸秆的微生物附着特征，XPS测试煤的表面元素赋存形态变化特征。结果表明，瘦煤、弱黏煤和焦煤与玉米秸秆最佳质量比为2:1、2:1、3:1，相应的甲烷产量分别为17.28、12.51和14.88 mL/g，不同煤阶煤与秸秆联合发酵的促进效果依次为瘦煤>焦煤>弱黏煤。菌群鉴定揭示了混合发酵体系中球螺菌属(Sphaerochaeta)和噬蛋白菌属(Proteiniphilum)为优势细菌属，分别占35.95%和24.36%，而优势古菌属为甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和甲烷丝菌属(Methanoculleus)，分别占比达到49.71%、31.83%和9.87%。瘦煤与焦煤和弱黏煤相比，联合发酵液中代谢糖类物质的细菌属及古菌属和基因功能占据优势，而这与甲烷产气规律趋于一致。不同混合底物发酵时，随着煤阶的升高，煤表面的菌群附着量逐渐减少，而玉米秸秆表面始终附着大量菌群，表明玉米秸秆始终具有降解优势。联合发酵后焦煤和弱黏煤表面C元素相对含量相比于瘦煤减少更加明显，而含氧有机碳（C—O、C=O和O—C=O）的总相对含量明显升高，表明联合发酵能够促进菌群生长代谢，使得更多有机碳转化为生物甲烷，研究结果查明了不同煤阶煤与玉米秸秆联合发酵在微观层面上的作用效果，对于揭示煤与玉米秸秆联合发酵内在机制具有参考意义。
Abstract:Adding corn straw to the anaerobic fermentation system of coal can significantly increase the gas production of coal-to-biomethane. However, the changes in substrate and microbial metabolism accompanying this combined fermentation are rarely studied. The Scanning Electron Microscope (SEM) test was utilized to analyze the microbial adhesion characteristics of coal and corn straw, while the X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) test examined the changes in surface elements of coal. The results indicated that the optimal ratios of lean coal, weakly caking coal, and coking coal to corn straw were 2∶1, 2∶1, and 3∶1, respectively, and the corresponding methane yields were 17.28 mL/g, 12.51 mL/g, and 14.88 mL/g. The promotional effect of co-fermentation of different rank coal and straw was observed in the order of lean coal > coking coal > weakly caking coal. Microbial identification revealed that Sphaerochaeta and Proteiniphilum were the dominant bacterial genera in the mixed fermentation system, comprising 35.95% and 24.36% of the population, respectively. Additionally, Methanosarcina, Methanobacterium, and Methanoculleus emerged as the dominant archaea, constituting 49.71%, 31.83%, and 9.87%, respectively. In comparison with coking coal and weakly caking coal, the bacterial and archaeal genera, along with their associated gene functions responsible for carbohydrate metabolism in the combined fermentation broth of lean coal, coking coal, and weakly caking coal, were found to be dominant. This observation aligns with the principles governing methane production. Notably, in mixed substrate fermentation, as coal rank increased, bacterial presence on the coal surface gradually declined, while a substantial bacterial population consistently adhered to the surface of corn straw, indicating the latter's sustained advantage in degradation. After co-fermentation, the relative content of C element on the surface of coking coal and weakly caking coal decreased more significantly than that of lean coal, while the total relative content of oxygen-containing organic carbon ( C—O, C=O and O—C=O ) increased significantly, indicating that co-fermentation can promote the growth and metabolism of bacteria, so that more organic carbon can be converted into biological methane. The research results identified the effect of co-fermentation of different rank coal and corn straw at the micro level, which has reference significance for revealing the internal mechanism of co-fermentation of coal and corn straw.
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0. 引 言
煤制生物甲烷是获取清洁能源、实现“双碳”目标的重要途径之一。目前，提高转化效率的方式主要包括物理法（如超声波预处理、超临界萃取）[1-2]、化学法（如酸、碱、氧化预处理）[3]、生物法（如菌种预处理）[4-5]和生物质协同共降解[6]。同时，通过添加营养剂来刺激煤层菌群的生长和活性，可以提高生物气产量[7-8]。然而，如果要实现煤制生物气的商业化，煤中较低的H/C元素质量比、稳定的芳构化结构和较低的孔隙率依然是限制煤高效降解的内在因素[9-11]。
我国作为农业大国，每年农作物秸秆产量近10亿t[12]。生物质秸秆具有充足的可获得性、低成本以及良好的碳中和性等优势，被视为沼气生产的理想底物，在生物质发酵领域得到了广泛研究[13]。将生物质秸秆作为外部碳源可刺激煤生物产甲烷的初期提高菌群活性，同时高H/C元素质量比与煤也有良好的互补性，因此，考虑两者共发酵是提高煤生物甲烷产量的有效方法。
已有研究证实煤的生物降解后侧链以及含氧官能团数目大量地增加，并且生物降解后的煤样孔裂隙增加，连通性增强，孔隙结构得到进一步改善[14]。同时，微生物对煤的吸附能力与煤的生物转化成正相关关系，其中煤阶的差异影响其粘附程度[15]，发酵系统中微生物群落结构分布特征也会影响甲烷的生成[16]。尽管煤与玉米秸秆联合发酵生产生物甲烷是一项有潜力的研究方向，但仍然存在一些尚待解决的问题。一方面，煤的结构复杂，含有许多难降解的有机物，这些物质可能抑制产甲烷的微生物活性，从而降低反应效率。前人仅对煤作为单一底物开展了研究，而煤与玉米秸秆联合发酵后底物代谢的变化规律还没有形成统一认识。另一方面，煤和玉米秸秆的联合发酵需要特定的微生物群落来完成生物甲烷的代谢。这些微生物需要适应煤和秸秆联合发酵系统的复杂环境，并且能够有效地协同作用。然而，当前对于这些微生物的了解仍然有限，需要深入研究微生物的适应性和功能。本文借助扫描电子显微镜（SEM）、X射线光电子能谱（XPS）、16S核糖体RNA（16S rRNA）等测试手段，探讨煤与玉米秸秆协同发酵后煤的官能团变化、菌群在底物上的附着特征和群落结构，为查明混合底物联合发酵机制提供借鉴。
1. 试验材料与方法
1.1 样品制备
试验所用煤样采自山西运城王家岭矿瘦煤，河南平顶山首山一矿焦煤和山西大同煤峪口矿弱黏煤。玉米秸秆采自河南省焦作市永兴屯村。将煤样粉碎至80～100目（0.15 mm～0.18 mm），秸秆粉碎过30目（0.60 mm）筛。选用新疆准南某区块中低阶煤中菌群经多代驯化作为菌种来源。根据GB/T 30732—2014《煤的工业分析方法仪器法》和GB/T 31391—2015《煤的元素分析》进行样品的工业分析与元素分析。煤样与秸秆的基本信息见表1。
表 1 样品基本信息Table 1. Basic information of samples% 样品（编号） Mad Aad Vad Ro,ran Cdaf Hdaf Ndaf (O+S)daf 瘦煤（SM） 0.97 21.33 14.36 1.67 78.32 3.94 0.51 17.32 焦煤（JM） 0.99 13.98 17.64 1.41 57.34 4.07 0.21 38.38 弱黏煤（RNM） 2.83 3.98 26.95 0.79 55.53 4.49 0.00 39.98 玉米秸秆（YM） 11.14 11.29 61.56 — 63.12 5.48 1.07 30.33 1.2 菌种驯化方案
产甲烷菌富集培养基配方：每1 L蒸馏水中加入K2HPO4 0.4 g，MgCl2 0.1 g，KH2PO4 0.2 g，酵母膏1.0 g，胰蛋白胨0.1 g，NH4Cl 1.0 g，乙酸钠0.5 g，甲酸钠0.5 g，微量元素液10.0 mL。还原剂：半胱氨酸盐0.5 g，Na2S 0.2 g，NaHCO3 2 g。其中，微量元素液配方：每1 L蒸馏水中加入氨基三乙酸1.5 g，MnSO4·2H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 1 g，CoCl2·6H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.01 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，H3BO3 0.01 g，KAl(SO4)2 0.01 g，NiCl2·6H2O 0.02 g，Na2MoO4 0.01 g。
试验前，需对经过多代驯化的菌液进行再富集培养以激发产甲烷菌的活性。将配制好的培养基放置灭菌锅内于121 ℃灭菌20 min，灭菌完成后待其冷却至室温时取出。用1 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH将其pH调至7。以体积比1:5的比例将驯化的菌液与培养基混合，并通入5 min 氮气以驱替空气，迅速用封口膜密封，在35 ℃恒温培养箱内进行为期7 d的富集[17]。
1.3 生物产气模拟试验
将预先准备的试验样品和200 mL富集的菌液加入经过高压灭菌的250 mL锥形瓶内，并通入3 min高纯氮气置换瓶内空气，以保证严格厌氧环境。迅速用封口膜密封瓶口并连接集气袋以收集气体，后将其置于35 ℃恒温培养箱中。各组试验样品信息见表2。各产气试验设置3个平行样，产气周期为30 d，每3 d记录一次产气量并对甲烷进行定量分析，取产气高峰期发酵液进行菌种分析。甲烷定量分析使用来自美国安捷伦科技有限公司生产的Agilent 7890GC型气相色谱仪。
表 2 联合发酵底物配比Table 2. Substrate ratios for co-fermentation样品编号 底物类型 煤样质量/g 玉米秸秆质量/g 底物总质量/g 煤与玉米秸秆质量比 KB 培养基 — — — — SM 瘦煤 1 0 1 — SY-2 瘦煤 4 2 6 2∶1 SY-3 瘦煤 6 2 8 3∶1 SY-4 瘦煤 8 2 10 4∶1 JM 焦煤 1 0 1 — JY-2 焦煤 4 2 6 2∶1 JY-3 焦煤 6 2 8 3∶1 JY-4 焦煤 8 2 10 4∶1 RNM 弱黏煤 1 0 1 — RY-2 弱黏煤 4 2 6 2∶1 RY-3 弱黏煤 6 2 8 3∶1 RY-4 弱黏煤 8 2 10 4∶1 YM 秸秆 0 1 1 — 1.4 菌群附着状态
取产气高峰期煤样与玉米秸秆样品后，分别依次使用体积分数为2.5%戊二醛浸泡2～4 h，磷酸缓冲液清洗3次，乙醇梯度脱水（体积分数30%、50%、70%、85%、95%）各一次，体积分数为100%乙醇2次，每次浸泡15～20 min，最后煤样在35 ℃烘干箱中进行干燥处理。在Cressington108Auto离子溅射仪镀膜后，采用FEI QUANTA FEG 250扫描电子显微镜（SEM）观察煤与玉米秸秆样品断面形貌，样品仓尺寸为120×120 mm，配有电子背散射衍射仪。
1.5 表面元素赋存形态测试
采用赛默飞EscaLab 250Xi X射线光电子能谱仪（XPS）检测发酵前后煤样表面（1～10 nm厚度）的元素种类、化学价态以及相对含量。仪器成像分辨率小于3 µm，单色X射线束可聚焦成900 µm至200 µm的束斑，平均半径为150 mm，检测能量范围0～5 000 eV，光学系统的视场范围300 μm～2.5 mm。
1.6 微生物结构功能测试
在生物产气高峰期采集发酵液，研究微生物群落结构组成和优势菌种。使用快速DNA旋转提取试剂盒提取发酵液中的细菌与古菌总基因组DNA样本。PCR扩增选用细菌16S rRNA区特异性引物V3-V4区338F（5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3’），古菌16S rRNA区特异性引物V8-V9区1106F（5’-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3’）和1378R（5’-TGTGCAAGGAGCAGGGAC-3’）。使用Agencourt AMPure Beads (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)纯化扩增产物，之后利用PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 对PCR 产物在Microplate reader (BioTek, FLx800)上进行定量，然后按照每个样品所需的数据量进行混样。之后将样品交付上海派森诺有限公司进行建库，并在MiSeq机器上利用MiSeq Reagent Kit V3进行2×300 bp的双端测序。微生物代谢基因功能通过PICRUSt软件进行预测。
2. 结果与讨论
2.1 生物产气特征分析
由图1a可以看出瘦煤和弱黏煤与玉米秸秆产气最优组合质量比为2∶1，而焦煤与玉米秸秆最优产气组合为3∶1的质量比。不同发酵底物的累计产气量之间存在较大差异，其中瘦煤和弱黏煤的最优产气组合SY-2和RY-2产气量分别为234 mL和226 mL，高于最低产气组合SY-3和RY-3产气量162.92％和103.60％。而焦煤不同组合产气量差异更为显著，其最优组合JY-3的产气量为287 mL，高于最低产气组合JY-2产气量6倍。同时，各产气组合的甲烷产量也不尽相同（图1b），甲烷产量的最优组合与累计产气量最优组合一致，即为SY-2、JY-3和RY-2产气组合，且其甲烷产量分别为17.28、14.88和12.51 mL/g。不同底物间产气特征存在差异可能与底物的成分、结构、微生物群落等因素有关[3]。瘦煤、焦煤和弱黏煤以及玉米秸秆具有不同的化学成分和结构。不同底物导致不同的微生物群落在发酵过程中生长和活动，这可能导致不同的代谢途径和产气特性。这些差异可能导致不同底物在厌氧发酵过程中受到微生物代谢和降解的影响程度不同，进而影响产气特征。
通过进一步分析最优产气组合SY-2、JY-3和RY-2阶段性产气数据，可以发现SY-2在产气过程中的第13～15 d、JY-3和RY-2在产气过程中的第10～12 d收集的气体为产气最大值，因此这些产气时间段即为相应最优产气组合的产气高峰期。此外，通过对不同单一底物进行厌氧发酵生物产气试验，得到瘦煤（SM）、焦煤（JM）、弱黏煤（RNM）、玉米秸秆（YM）的生物甲烷产量分别为0.60、1.20、1.18、11.01 mL/g，远小于煤与秸秆联合发酵的甲烷产量，例如瘦煤与秸秆甲烷产量为17.28 mL/g、焦煤与秸秆甲烷产量为14.88 mL/g和弱黏煤与秸秆联合发酵的甲烷产量为12.51 mL/g。以甲烷产量为指标，将单煤和单玉米秸秆的甲烷产量之和与混合底物最优产气组合进行对比。SM与YM的甲烷产量之和为11.61 mL/g，SY-2的甲烷产量为17.28 mL/g，同比增加了48.84%；JM与YM的甲烷产量之和为12.21 mL/g，JY-3的甲烷产量为14.88 mL/g，同比增加了21.87%；RNM与YM的甲烷产量之和为12.19 mL/g，RY-2的甲烷产量为12.51 mL/g，同比增加了2.63%。由此可见，煤与玉米秸秆混合厌氧发酵使甲烷产量达到了1+1>2的效果，不同煤阶的促进效果依次为瘦煤>焦煤>弱黏煤（表3）。
表 3 不同底物生物产气结果Table 3. Biogas production results of different substrates样品编号 甲烷产量/(mL·g−1) 样品编号 甲烷产量/(mL·g−1) KB 0.20 JY-3 14.88 SM 0.60 JY-4 5.93 SY-2 17.28 RNM 1.18 SY-3 3.78 RY-2 12.51 SY-4 3.31 RY-3 4.25 JM 1.20 RY-4 6.71 JY-2 0.69 YM 11.01 2.2 微生物群落结构分析
2.2.1 细菌结构分析
图2a为产气高峰期细菌在属水平上的菌种组成及其相对丰度，综合分析可以看到Sphaerochaeta和Proteiniphilum为优势细菌属，相对丰度为35.95%和24.36%，同时存在一些占比相对较少的菌属，如赖氨酸芽孢杆菌属 (Lysinibacillus)、森林土源芽孢杆菌属 (Solibacillus)和泥单胞菌属(Petrimonas)等。不同种类的微生物代谢底物不同，Sphaerochaeta可代谢单糖、二糖和多糖等糖类物质产生乙酸盐、乙醇、氢气和二氧化碳[18]，而Proteiniphilum可代谢酵母膏和蛋白胨等有机物产生乙酸和二氧化碳[19]。对比SY-2、JY-3和RY-2可以发现，SY-2中溶杆菌属(Lysinibacilum)相对丰度最高，菌种组成最为丰富，且存在其他两组发酵体系中未被检测到的Lysinibacilum，该菌属可代谢单糖和二糖转化为丙酸、乙酸和少量丁酸[20]。而JY-3和RY-2中细菌属以Sphaerochaeta和Proteiniphilum为主，可检测到的菌种丰富度相对较低。SY-2中多为代谢糖类物质的细菌属，且菌种丰富度高于JY-3和RY-2，推测这是其甲烷产量更高的原因之一。
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图 2 菌种组成及其相对丰度Figure 2. Species composition and their relative abundance of bacteria and archaea2.2.2 古菌结构分析
图2b为产气高峰期古菌在属水平上的菌种组成及其相对丰度，可以发现优势菌属为Methanosarcina、Methanobacterium和Methanoculleus，相对丰度可达49.71%、31.83%和9.87%。其中，Methanosarcina属于极端严格厌氧菌，可代谢甲基类物质生成CH4、CO2和NH3，且在含H2环境下，可将甲醇和甲基胺还原为CH4，同时还可代谢H2/CO2或乙酸，因此属于混合型产甲烷菌[21]。Methanobacterium也属于极端严格厌氧菌，可将CO2还原为CH4，属于氢营养型产甲烷菌[22]。而Methanoculleus以H2/CO2或甲酸钠为代谢底物生产CH4。对比SY-2、JY-3和RY-2可以看出，SY-2中Methanosarcina相对丰度较高，达到60.28%，同时Methanoculleus也占据一定比重（17.35%），此外，检测到相对丰度为19.53%的甲烷鬃菌属(Methanosaeta)，但这个菌种在JY-3和RY-2中占比极低。Methanosaeta是严格的乙酸营养型产甲烷菌，也可以通过直接种间电子转移（DIET）与将CO2还原为甲烷[23]。JY-3和RY-2中占绝对优势的菌属分别为Methanosarcina和Methanobacterium，其相对丰度分别可达81.27%和85.93%。SY-2中的产甲烷菌属丰度相对均匀，而JY-3和RY-2中类型相对单一，这是造成前者甲烷产量偏高的原因。综上可知，煤与秸秆生物产气效果受菌群结构影响较大，菌群结构中出现较多优势菌种时，往往伴随着较好的水解、产酸和产甲烷效果。
2.3 基因功能分析
为了分析不同底物下甲烷产量和基因功能之间的关系，对3个试验组的细菌基因功能丰度进行对比分析（图3）。SY-2、JY-3和RY-2的细菌功能基因总丰度分别为
234444 、216510 和227488 ，可见SY-2的基因功能丰度高于JY-3和RY-2，表明瘦煤与玉米秸秆联合发酵更有利于生物甲烷的生成。![]()
图 3 不同发酵底物在产气高峰期的细菌基因功能丰度Figure 3. Functional abundance of bacterial genes in different fermentation substrates at the peak of gas production京都基因组百科全书（KEGG）的代谢途径中相对频繁的细菌基因功能是：“碳水化合物生物合成、碳水化合物降解、高分子化合物降解、辅因子、辅基、电子载体、维生素生物合成、脂肪酸和脂质生物合成、次级代谢产物生物合成、芳香族化合物降解、碳水化合物降解、电子转移、糖酵解、超级通路”。3个试验组中，RNM因煤阶最低，使其更容易被厌氧菌群降解利用，因此，RY-2中参与“碳水化合物生物合成、碳水化合物降解、高分子化合物降解”这3种基因功能的丰度较大。“糖酵解”是指在无氧条件下，葡萄糖在细胞质中被分解成为丙酮酸的过程，发酵体系中较多的丙酮酸可产生更多的挥发性脂肪酸，这与“脂肪酸与脂质生物合成”可以共同体现水解阶段生成挥发性脂肪酸的活跃度，此外其它基因功能丰度大小也将直接反映联合发酵水解阶段的剧烈程度，SY-2中这些基因功能丰度均最高，说明其水解阶段存在剧烈的水解强度，为产甲烷菌提供更多的营养物质。同时，SY-2中较丰富的“脂肪酸与脂质生物合成”功能基因，这也佐证了其群落结构中乙酸营养型产甲烷菌丰度较高的结果。综上可知，煤与秸秆联合发酵产甲烷效果与细菌功能基因丰度相关，相关基因丰度越高，对于煤与秸秆联合发酵产甲烷效果越明显。
2.4 菌群附着特征
为了深入了解3个最优产气组合的微观特征，首先进行了SEM测试以分析各样品的微生物附着特征。如图4a、4c、4e所示，3种煤SY-2、JY-3及RY-2表面均附着有微生物，但具体附着特征不同。SY-2中煤样表面存在球状菌（直径0～1 μm）和杆状菌（长度5～10 μm），但数量相对较少。JY-3煤样表面杆状菌（长度5～20 μm）附着相对较多。RY-2中煤样表面存在分布较为均匀的球状菌（直径0～2 μm）和杆状菌（长度4～8 μm）。同时，观测到玉米秸秆样品表面存在微生物相对于煤样数量较多。SY-2中的玉米秸秆以球状菌（直径0～2 μm）和杆状菌（长度0～8 μm）为主，而JY-3玉米秸秆样品表面菌群聚集，可能存在协同共生关系，RY-2中玉米秸秆样品表面菌群形成一个团簇覆盖在秸秆表面。在各样品表面菌群周围观察到大量菌群分泌物的存在，表明此时菌群代谢活动较强。
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图 4 产气高峰期煤与秸秆表面形貌与菌种附着特征Figure 4. Surface morphology and strain attachment characteristics of coal and straw during peak gas production煤上黏附微生物与煤之间存在相互作用关系，即细胞在煤表面粘附的决定因素是给电子能力和疏水性。当细胞和煤表面均具有相似的较低给电子能力且煤表面疏水性较高更可能发生两者的附着[24]。研究表明，优势细菌（Sphaerochaeta）和古菌（Methanosarcina）等具有高给电子表面容量[25]，这些条件促进了其与煤的粘附，而SY-2煤样的变质程度较高，给电子表面电位强，导致煤与微生物表面的共享电子差异较小，不利于菌群粘附。此外，影响细胞在煤上附着的另一个重要因素是范德华相互作用，而范德华表面能分量决定了相互作用的强度，范德华表面能分量越高越有利于细胞粘附[13]。与瘦煤和焦煤相比，弱黏煤煤阶低，亲水性强，表面能分量较高，这使其与微生物间产生更大的粘附力[26-27]。因此，可以发现随着煤阶的升高，煤表面的菌群附着量逐渐降低。而随着煤阶的升高，煤的微生物利用度会下降，图4b中SY-2玉米秸秆样品表面菌群数量远高于煤样表面（图4a），表明如果发酵底物中存在高煤阶煤，菌群会优先降解玉米秸秆，并且玉米秸秆表面菌群的附着量会随着煤阶的增加而增加。综上可知，低阶煤表面相对于高阶煤更容易附着细菌，煤与秸秆产甲烷效果越好，附着在煤和秸秆表面的菌群相对较多。
2.5 煤表面元素含量及化学赋存状态变化特征
不同样品生物产气后表面赋存元素占比见表4。由表4可知，煤中C元素含量占绝对优势（78.28%～92.46%），其次是O元素（5.43%～14.53%），而N和S元素相对含量较低。同时，3种煤样的C元素相对含量相近，其中，焦煤（JM）的C元素相对含量最高，而弱黏煤（RNM）的O/C原子数之比最高。产气结束后，3种煤的C元素相对含量有所降低，而O元素相对含量增加，且随着煤阶的降低，O/C原子数比依次增加。表明煤与玉米秸秆共发酵后中芳香烃、杂环和脂肪烃类物质被微生物部分降解，使3种煤的C元素相对含量降低，而N、O和S元素仅作为营养物质被微生物代谢利用极少，导致相对含量增加。
表 4 不同样品生物产气后表面赋存元素占比Table 4. The atomic percentage of different samples样品编号 原子数占比/% O/C原子数比/% C N O S SM 89.03 2.06 7.69 0.34 8.64 SY-2 87.26 3.85 8.59 0.30 9.84 JM 92.46 1.80 5.43 0.31 5.87 JY-3 87.01 3.64 9.02 0.32 10.37 RNM 90.39 1.50 7.96 0.15 8.81 RY-2 78.28 6.91 14.53 0.27 18.56 煤表面有机碳存在4种形态，包括芳香单元及其取代烷烃（C—C、C—H）、酚碳或醚碳（C—O）、羰基碳（C=O）、羧基碳（COO—）。利用Avantage软件对高分辨率XPS光谱进行拟合和量化，并在Smart模式下进行不同煤样的C1s窄扫谱图分峰拟合。不同煤样C1s窄扫谱图分峰拟合结果如图5所示，赋存形态归属结果见表5。
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图 5 不同煤样的C1s窄扫谱图分峰拟合Figure 5. Split-peak fitting of C1s narrow-sweep spectra of different coal samples表 5 不同煤样的碳元素赋存形态归属Table 5. Attribution of the carbon element distribution pattern of different coal samples样品编号 官能团含量/% C—C，C—H C—O C=O COO— SM 84.67 5.41 6.45 3.47 SY-2 80.05 8.93 9.37 1.65 JM 60.23 22.12 11.64 6.01 JY-3 80.05 9.39 8.75 1.81 RNM 62.51 26.14 5.07 6.28 RY-2 73.94 14.84 10.25 0.97 由图5和表5可知，煤样表面有机碳赋存形态以芳香单元及其取代烷烃（C—C、C—H）为主，而羧基碳（COO—）相对含量最少。产气结束后，C—C、C—H相对含量SM中减少了4.62%，而JM和RNM分别增加了19.82%和11.43%。与之对应的是，含氧有机碳（C—O、C=O和COO—）总含量SM中增加，JM和RNM均有减少。煤中的侧链及官能团容易被生物酶攻击并转化利用，且微生物会利用煤本身外的O原子，使煤结构中原有的侧链、含氧官能团大量增加，从而煤结构中以桥键连接的键能较低的不规则部分脱落进入发酵液，参与甲烷的生物转化[25]。
综上，结合群落结构和生物产气效果可知，SY-2中微生物优先降解玉米秸秆，因此SY-2中SM的含氧有机碳未被菌群充分利用，导致其发酵结束后含氧官能团相对含量增高，进而芳香碳相对含量减少。而JY-3和RY-2煤表面含氧有机碳较多被生物转化，从而相对含量显著减少，进而芳香碳相对含量升高。因此，联合发酵底物中随着煤阶的升高，玉米秸秆对生物产气的贡献更大，同时，添加玉米秸秆促进了中低煤阶的生物甲烷化。
3. 结 论
1) 低阶煤和玉米秸秆联合发酵能够显著提高生物甲烷的产量，且不同煤阶煤和玉米秸秆在合适的底物配比中也具有较好的生物产气潜力。
2) 低阶煤与秸秆联合发酵产气高峰期优势菌种丰度占比较大，表明低阶煤更容易被微生物降解利用，使优势细菌代谢能力增强，由此导致水解、产酸和产甲烷过程得到强化，进而促进了甲烷的产生。
3) 煤与秸秆联合发酵产气高峰期，煤表面的菌群附着量随着煤阶的升高逐渐降低，相关细菌的附着使得底物降解作用增强，从微观层面揭示了低阶煤和秸秆联合发酵生物产气的优势。
4) 不同煤阶煤与秸秆联合发酵过程中，表面元素中C元素相对含量有所降低，而O元素相对含量增加，低阶煤中的侧链及官能团容更易被生物酶攻击并转化利用，由此导致在联合发酵过程中低阶煤生物甲烷产量更容易提高。
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图 2 菌种组成及其相对丰度
Figure 2. Species composition and their relative abundance of bacteria and archaea
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图 3 不同发酵底物在产气高峰期的细菌基因功能丰度
Figure 3. Functional abundance of bacterial genes in different fermentation substrates at the peak of gas production
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图 4 产气高峰期煤与秸秆表面形貌与菌种附着特征
Figure 4. Surface morphology and strain attachment characteristics of coal and straw during peak gas production
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图 5 不同煤样的C1s窄扫谱图分峰拟合
Figure 5. Split-peak fitting of C1s narrow-sweep spectra of different coal samples
表 1 样品基本信息
Table 1 Basic information of samples
% 样品（编号） Mad Aad Vad Ro,ran Cdaf Hdaf Ndaf (O+S)daf 瘦煤（SM） 0.97 21.33 14.36 1.67 78.32 3.94 0.51 17.32 焦煤（JM） 0.99 13.98 17.64 1.41 57.34 4.07 0.21 38.38 弱黏煤（RNM） 2.83 3.98 26.95 0.79 55.53 4.49 0.00 39.98 玉米秸秆（YM） 11.14 11.29 61.56 — 63.12 5.48 1.07 30.33 
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表 2 联合发酵底物配比
Table 2 Substrate ratios for co-fermentation
样品编号 底物类型 煤样质量/g 玉米秸秆质量/g 底物总质量/g 煤与玉米秸秆质量比 KB 培养基 — — — — SM 瘦煤 1 0 1 — SY-2 瘦煤 4 2 6 2∶1 SY-3 瘦煤 6 2 8 3∶1 SY-4 瘦煤 8 2 10 4∶1 JM 焦煤 1 0 1 — JY-2 焦煤 4 2 6 2∶1 JY-3 焦煤 6 2 8 3∶1 JY-4 焦煤 8 2 10 4∶1 RNM 弱黏煤 1 0 1 — RY-2 弱黏煤 4 2 6 2∶1 RY-3 弱黏煤 6 2 8 3∶1 RY-4 弱黏煤 8 2 10 4∶1 YM 秸秆 0 1 1 —
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表 3 不同底物生物产气结果
Table 3 Biogas production results of different substrates
样品编号 甲烷产量/(mL·g−1) 样品编号 甲烷产量/(mL·g−1) KB 0.20 JY-3 14.88 SM 0.60 JY-4 5.93 SY-2 17.28 RNM 1.18 SY-3 3.78 RY-2 12.51 SY-4 3.31 RY-3 4.25 JM 1.20 RY-4 6.71 JY-2 0.69 YM 11.01
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表 4 不同样品生物产气后表面赋存元素占比
Table 4 The atomic percentage of different samples
样品编号 原子数占比/% O/C原子数比/% C N O S SM 89.03 2.06 7.69 0.34 8.64 SY-2 87.26 3.85 8.59 0.30 9.84 JM 92.46 1.80 5.43 0.31 5.87 JY-3 87.01 3.64 9.02 0.32 10.37 RNM 90.39 1.50 7.96 0.15 8.81 RY-2 78.28 6.91 14.53 0.27 18.56
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表 5 不同煤样的碳元素赋存形态归属
Table 5 Attribution of the carbon element distribution pattern of different coal samples
样品编号 官能团含量/% C—C，C—H C—O C=O COO— SM 84.67 5.41 6.45 3.47 SY-2 80.05 8.93 9.37 1.65 JM 60.23 22.12 11.64 6.01 JY-3 80.05 9.39 8.75 1.81 RNM 62.51 26.14 5.07 6.28 RY-2 73.94 14.84 10.25 0.97
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