Structure characteristics of microbial community in acid mine drainage in Shandi River Basin
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摘要:
为了揭示不同氧化还原环境条件下酸性矿井水微生物群落结构特征及其与水环境相互作用关系，选取娘子关泉域内典型废弃煤矿区山底河流域，采集不同氧化还原环境的AMD水样，用于水化学同位素分析和微生物16S rRNA基因V4、V5区测序。水化学同位素分析得出AMD水化学特征主要受pH和围岩水岩作用影响，好氧和厌氧环境下AMD的pH与Eh呈负相关；缺氧厌氧环境下AMD的pH与 Fe3+、Eh呈负相关。AMD中Ca、Mg离子则主要来源于围岩和煤中方解石、白云石的溶解；K、Na主要来源于长石等硅酸岩在酸性条件下的溶解；${\mathrm{SO}}_4^{2-} $、Fe含量主要来源含煤地层中黄铁矿氧化；AMD的硫同位素演化特征为好氧环境下AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $较低，缺氧厌氧环境下AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $较高。山底流域AMD微生物多样性影响分析，得出pH越低，样品的细菌丰度和多样性越低；温度越高样品的细菌丰度和多样性越高。通过AMD的微生物群落与环境因子的相关性分析，得出柳沟AMD的优势菌属为Ferrovum、Gallionella和Ferritrophicum。庙沟露天矿AMD的优势菌属为Ferrovum、Gallionella和Acidithiobacillus。榆林垴钻井AMD的优势菌属为Ferrovum和Gallionella。山底河流域AMD的微生物群落受pH、温度和降水的影响较大。
Abstract:In order to reveal the structural characteristics of microbial communities in acid mine drainage(AMD) under different redox environmental conditions and the interaction between microbial communities and groundwater environment, Select the typical abandoned coal mining area in the Shandi River basin of the Niangziguan Spring area, and collect AMD samples from different redox environments for Hydrochemical characteristics and isotope analysis and the high-throughput sequencing of the V4, V5 region of microbial 16S rRNA. The analysis of Hydrochemical characteristics and isotope indicates that the hydrochemical characteristics of AMD are mainly influenced by pH and surrounding rock. The analysis of hydrochemical isotopes shows that the hydrochemical characteristics of AMD are mainly influenced by pH and rock water interaction. Under aerobic and anaerobic environments, the pH of AMD is negatively correlated with Eh; The pH of AMD in anaerobic and hypoxic environments is negatively correlated with Fe3+and Eh.The Ca and Mg ions in AMD mainly come from the dissolution of calcite and dolomite in the surrounding rock and coal. The K and Na ions in AMD mainly come from the dissolution of silicate rocks such as feldspar under acidic conditions; The main source of ${{\mathrm{SO}}_4^{2-}} $ and Fe content in AMD is the oxidation of pyrite in coal-bearing strata; The sulfur isotope evolution of AMD is characterized by lower δ34S–${{\mathrm{SO}}_4^{2-}}$ values in aerobic environments and higher δ34S–${{\mathrm{SO}}_4^{2-}}$ values in anaerobic and hypoxic environments. The analysis of the microbial diversity impact of AMD in the bottom of the mountain basin shows that the lower the pH, the lower the bacterial abundance and diversity of the sample; The higher the temperature, the higher the bacterial abundance and diversity of the sample. Through the correlation analysis between the microbial community and environmental factors of AMD, it was found that the dominant bacterial genera in the Liugou are Ferrovum, Gallionella and Ferritrophicum. The dominant genera of AMD in the Miaogou open-pit mine are Ferrovum, Gallionella and Acidithiobacillus. The dominant genera of AMD in Yulinnao drilling are Ferrovum and Gallionella. The microbial community of AMD in the Shandi River Basin is greatly affected by pH, temperature and precipitation.
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0. 引 言
酸性矿井水(Acid Mine Drainage, AMD)为由煤层和围岩中含有的硫化物在 O2、H2O 及微生物的共同作用下，发生氧化反应所形成的。一般认为AMD的形成是氧化亚铁硫杆菌、Fe3+和 O2共同作用的结果。酸性矿山环境广泛分布于全球范围内，已有研究[1-2]表明微生物在AMD的形成过程中发挥着重要作用，它们能够氧化二价铁或还原无机硫化物来获得能量，从而加速硫化矿物的溶解。国内外学者对酸性矿山环境水体中微生物群落特征进行了大量研究，获得了诸多成果。
近年，盛益之[3]通过对AMD流经阶梯状含铁建造过程中发生的生物地球化学过程进行监测，发现细菌门类Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria 、 Alphaproteobacteria 、Nitrospirae和Actinobacteria为沉积物中的优势微生物群落(>95%)，其相对丰度主要受pH和二价铁离子浓度的影响。ZHANG 等[4]对江西德兴铜矿的 AMD 样品进行宏基因组分析后发现，群落中主要是细菌中的变形菌门，古菌占比极低。HAO等[5]对安徽某铁矿微生物群落的季节变化进行高通量测序分析后发现，真核藻类Chlamydomonas在冬季12月左右的含量显著上升。ETTAMIMI等[6]利用16S rRNA测序手段研究了受葡萄牙南部 São Domingos 矿区酸性废水污染水体的原核群落多样性，在污染最严重的区域(pH=2.3～3.1)检测出高丰度的钩端螺旋菌 Leptospirillum、硫单胞菌Thiomonas和化能异养铁还原菌 Acidiphilium等菌属大部分地区矿井水中存在严格自养酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)和钩端螺旋菌属(Leptospirillum)，以及可异养生长的硫化杆菌属(Sulfobacillus)、铁质菌属(Ferroplasma)和嗜酸菌属(Acidiphilium)等[7]。由于微生物的生长代谢与环境因素密切相关[8]，因此，各废弃矿山所处环境的不同会改变水中的无机和有机组分、氧化还原环境以及微生物的赋存与生长等条件[9]，进而诱发矿井内微生物群落的重新分布与演替[10]。环境条件和微生物群落结构的改变，将进一步影响水–微生物–矿物的相互作用[11]，控制酸性矿井水的产生[12]。
目前对典型废弃矿井的矿井水以及尾矿周边地下水微生物群落结构组成和演替规律的研究较多[13-14]，但对废弃煤矿井水在不同氧化还原条件下微生物群落结构的研究较少。
选取娘子关泉域内的山底河流域，分别对不同氧化还原条件下的AMD进行采样，分析不同氧化还原条件下AMD水化学特征基础上，选取微生物16S rRNA基因V4、V5 区进行高通量测序，分析不同氧化还原条件下微生物群落结构特征及其与水化学之间相关性，以期深入了解研究区不同氧化还原条件下AMD微生物群落结构特征，为AMD源头防治提供微生物基础依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况与采样
山底河流域位于娘子关泉域东北部，地理坐标为东经113°27′21″～113° 32′ 47″，北纬37°56′16″～38°02′31″，流域面积58.4 km2。流域内主采煤层为石炭系太原组的15号、12号、9号和8号煤层，在15号煤层上部稳定分布有一层厚度5～10 cm的黄铁矿层，且在太原组的砂岩裂隙中存在有大量黄铁矿结晶体[15]。2008年流域内的煤矿经过资源整合后，部分煤矿关闭，留下了许多巷道和采空区。大气降水与地表水通过断裂、坍塌裂隙补给地下水，水位回弹后将淹没废弃的矿坑、巷道和采空区。采空区内的煤层及其围岩中的硫铁矿在氧气、水和微生物作用下形成酸性矿井水。在2009—2010年期间，有部分闭坑煤矿的酸性矿井水开始溢出。随着生产矿井的进一步开采，目前采空区各含水层间已全部沟通，地下水从西南向东北方向径流，由于地层切割，地下水在山底村柳沟一带出露成泉，柳沟是AMD的集中排泄区(图1)。山底河流域内原有的煤矿开采方式既有井工开采又有露天开采，AMD的氧化还原环境可分为缺氧、厌氧和好氧型。
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图 1 山底河流域水文地质图和采样点Figure 1. Hydrogeological map and sampling sites of Shandi River Basin微生物的生长代谢与环境因素密切相关，水体所处环境的不同则微生物群落结构组成和演替规律不同。因此，为了探究山底河流域中不同氧化还原环境下AMD中微生物群落结构，以及各种群在群落中所占的比例，确定不同还原环境下AMD的优势菌属及丰度变化。本次微生物采样根据AMD的氧化还原环境结合地下水的补、径、排条件进行采样点选择(图2，表1)，其中柳沟样点(AMD01)为山底河流域AMD的主要的集中排泄点，是山底村废弃煤矿15号煤层的采空区矿井水溢出点。庙沟露天矿采样点(AMD02)为露天矿坑水，含水层位于12号煤层。小沟露天矿采样点主要为露天矿矿渣淋滤水。榆林垴钻井主要揭露采空区的石炭系太原组地层，钻孔水位在山西组15号煤层和本溪组长石砂岩层波动，榆林垴钻井样点(AMD04)为关闭废弃煤矿的坑道矿井水。
表 1 山底河流域AMD取样点基本情况Table 1. Basic situation of AMD sampling sites in Shandi River Basin样品 样品数量(组) 监测点类别 采空区煤层 氧化还原环境 水位标高/m 裂隙水 3 石炭二叠裂隙水 未开采 935.0～1 002.5 AMD01 12 采空区矿井溢出点 15号 缺氧 827.8 AMD02 12 露天矿坑水 12号 好氧 857.6 AMD03 12 露天矿矿渣淋滤水 15号 好氧 875.4 AMD04 12 采空区矿井水 15号 厌氧或缺氧 863.1 1.2 检测项目
采集水化学样品同时进行现场测试和实验室测试。现场测试的指标有pH、温度、电导率等指标。pH、温度和电导率用美国Eureka Manta4.0多参数水质仪现场测定。实验室测试的指标包括pH、电导率、溶解氧、Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+、Fe2+、Fe3+、Cl−、${\mathrm{SO}}_4^{2-} $、${\mathrm{CO}}_3^{2-} $、${\mathrm{HCO}}_3^- $、${\mathrm{NO}}_3^- $、${\mathrm{NO}}_2^- $、Mn、耗氧量、总溶解固体(Total Dissolved Solids，TDS)、总硬度和硫同位素(δ34S)等22项，测试项目由国土资源部太原矿产资源监督检测中心实验室完成，测试仪器为PHS–3C pH计、可见光光度计和离子色谱仪等测定。水质测试中对所有样品进行了阴阳离子平衡计算，相对误差均小于5%。硫同位素(δ34S)由中国地质调查局武汉地质调查中心实验室测试完成，测试仪器为德国赛默飞热电离质谱仪(TIMS)，标准采用CDT，测试精度(±0.05‰)。
采回的水样首先经过滤纸过滤除去泥沙等不溶物，其次让滤液通过0.22 μm微孔滤膜进行真空抽滤，使微生物截留在滤膜上，而后取出滤膜放于无菌离心管中，完成DNA抽提、PCR扩增及Miseq测序等工作，而后分析云平台提供的微生物群落信息。
1.3 数据分析
利用OriginPro统计分析研究区AMD水化学分布差异和变化规律。使用QIIME软件包对Illumina Miseq测序平台所获得的双端序列数据进行处理。并通过FLASH软件进行拼接和测序方向校正。按照97%的相似度，用UPARSE软件对序列进行OTU聚类。并70%比对阈值的条件下，用RDP classifier对每条序列的物种进行分类注释，同时通过与Silva 16S rRNA数据库的対比，确定每个16S rRNA基因序列的分类。MOTHU软件计算稀释曲线，利用OTU数量(Sobs)、ACE、Chao l、Shannon和 Simpson 指数估算细菌群落丰度和多样性。利用Welch’s T检验对样品组间α多样性指数进行差异分析。利用CCA分析（Canonical Correlation Analysis）或RDA分析（Redundancy Analysis）方法分析样品环境因子和物种的相关性。
2. 结果与分析
2.1 AMD水化学特征
2.1.1 AMD 水化学分析
如图2所示，裂隙泉的pH为7.60～7.80，均值为7.70。ρ(Ca2+)为76.6～84.6 mg/L，均值为81.4 mg/L。ρ(Mg2+)为9.1～12.7 mg/L，均值为10.3 mg/L。ρ(Na+)为13.0～21.4 mg/L，均值为17.1 mg/L。ρ(Cl−)为7.9～12.4 mg/L，均值为10.0 mg/L。ρ(${\mathrm{SO}}_4^{2-} $)为81.3～109.6 mg/L，均值为97.2 mg/L。ρ(${\mathrm{HCO}}_3^{-} $)为254.8～256.1 mg/L，均值为255.5 mg/L。ρ(Fe3++ Fe2+)为0.03～0.05 mg/L，均值为0.04 mg/L。ρ(Mn2+)为2.4～13.8 mg/L，均值为8.1 mg/L。
AMD的pH为2.32～7.68，均值为4.97。ρ(Ca2+) 为119.0～571.0 mg/L，均值为397.4 mg/L。ρ(Mg2+)为53.1～1 246.0 mg/L，均值为480.9 mg/L。ρ(Na+)为27.0～568.0 mg/L，均值为229.6 mg/L。ρ(Cl−)为3.2～103.0 mg/L，均值为27.4 mg/L。ρ(${\mathrm{SO}}_4^{2-} $)为1 194.0～14 500.0 mg/L，均值为4 932.5 mg/L。ρ(${\mathrm{HCO}}_3^{-} $)为0～441.0 mg/L，均值为163.5 mg/L。ρ(Fe3++ Fe2+)为0.6～1 984.0 mg/L，均值为294.0 mg/L。ρ(Mn2+)为0.2～87.6 mg/L，均值为19.7 mg/L。
榆林垴钻井样品pH均值为 7.30，ρ(${\mathrm{SO}}_4^{2-} $)均值为1 428.0 mg/L；柳沟样品pH均值为 2.89，ρ(${\mathrm{SO}}_4^{2-} $)均值为4 839.4 mg/L；庙沟样品pH均值为 2.57，ρ(${\mathrm{SO}}_4^{2-} $)均值为10 764.8 mg/L。
2.1.2 Durov图
Durov图能够清楚的表达pH、TDS、各种离子的毫克当量百分比和水化学类型。由图3可知，山底河流域AMD的水化学类型主要为SO4–Ca·Mg型，SO4–Mg型和SO4–Na型。其中柳沟和小沟露天矿的AMD水化学类型为SO4–Mg·Ca型，庙沟露天矿为SO4–Mg型，榆林垴钻井为SO4–Na型。榆林垴钻井和柳沟的ρ(Na+)均值分别为350.3和388.4 mg/L，榆林垴钻井和柳沟的ρ(Na+)远高于小沟露天矿、庙沟露天矿，推测榆林垴钻井和柳沟的AMD径流通道主要为15号煤层下伏的钠长石石英砂岩，Na+主要来源是由AMD与围岩水岩作用形成的。
2.1.3 氧化还原电位、pH、温度(T)和降水
Eh，也称作氧化还原电位，是衡量氧化还原反应强度的重要指标。Eh越高，氧化性越强，Eh越低，还原性越强。电位为正表示溶液具有一定的氧化性，电位为负则表示溶液具有一定的还原性。由表1可知，位于榆林垴钻井处的Eh均为–97.2 V，表明此处的AMD具有还原性。庙沟露天矿、小沟露天矿和柳沟的Eh分别为440.3、473.9和142.8 V，均为正值，表明这几个地方的AMD具有氧化性，且庙沟露天矿和小沟露天矿的Eh达到了400 V以上，它们的AMD氧化性强，其中小沟露天矿AMD的氧化性最强。
pH表达的是水体酸碱性的强弱，它是影响水体中水化学组成及(重)金属沉淀或溶解的重要因素之一，对AMD的水质有重要指示作用。由图3可知，位于榆林垴钻井的pH均值为7.30，表明缺氧厌氧环境下的AMD接近于中性；庙沟露天矿和柳沟AMD 的pH都小于4，表明这2处水体均呈现较强的酸性。
T为影响微生物生长和生物反应的最重要因素之一。AMD01、AMD02和AMD03为地下水溢出点，其T受气温的影响波动较大，其微生物生长受T影响较大；AMD04为地下水，其T较为稳定，微生物生长受T影响较小。山底河流流域2021年降雨量为479.2 mm；6～10月为雨季，降雨量约为414.4 mm。
2.1.4 Mg2+与Ca2+的比例
研究表明，Mg2+/Ca2+毫克当量浓度比值可以作为 “老窑水”及其酸化程度的一项特征性指标，可有效地应用于矿坑突水水源判别和污染朔源[16]。Mg2+/Ca2+毫克当量浓度比值反映了地下水水岩作用的强弱，值越大说明水岩作用越强，值越小说明水岩作用越弱[17-18]。各样点的Mg2+、Ca2+毫克当量浓度及比值如图4所示。由图4可以看出，庙沟露天矿AMD的比值最大，表明此处的AMD水岩作用最强。榆林垴钻井AMD的比值最小，表明榆林垴钻井AMD的水岩作用相对较弱。
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图 4 山底河流域AMD中 Ca2+与Mg2+关系Figure 4. Relationship between Ca2+ and Mg2+ in AMD in Shanxi River Basin2.1.5 AMD水化学同位素特征
中国北方岩溶地下水中${\mathrm{SO}}_4^{2-} $主要来自地层中的石膏夹层[19]，此外还有一部分来自于黄铁矿。通常来说石膏的34S值较高，而黄铁矿34S值小于石膏34S值。所以不少学者[20-23]常常利用硫酸盐中的34S示踪岩溶水中硫酸盐的物质来源，判断采矿活动对岩溶水的污染程度不同来源的硫同位素不同，大气沉降的δ34S为2‰～9‰，蒸发岩的δ34S值为–14‰～10‰，化肥的δ34S值为–3.9‰～3.7‰，煤的δ34S值为–5.9‰～10‰[24]，黄铁矿氧化物中δ34S值为–15‰～4‰[25]。
图5为山底河流域AMD样点${\mathrm{SO}}_4^{2-} $和pH随δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $变化的关系。由图5可知，位于榆林垴钻井处AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $均值最大，其次为柳沟，庙沟露天矿。小沟露天矿的δ34S均值最小。山底河流域AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $与pH相关性较好，与${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度相关性较差。
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图 5 山底河流域${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度和pH随δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $的变化Figure 5. Changes of ${\mathrm{SO}}_4^{2-} $ and pH with δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $ in Shanxi River Basin2.2 AMD 微生物群落结构
2.2.1 AMD微生物多样性分析
研究环境中微生物的多样性，可以通过单样本的Alpha(α)多样性分析微生物群落的丰富度和多样性，它可以通过一系列统计学分析指数来估计环境群落的物种丰度和多样性。其中 Chao1 指数和ACE 指数用于评估群落的丰度，Chao1和 ACE的指数越大，OTU数目越多，说明测试样本的物种数越多。Shannon 指数和 Simpson 指数可用于评估群落的多样性，Shannon指数越大、Simpson 指数越小，说明群落的多样性越高。Coverage指数主要反映微生物群落的覆盖度。
如图6所示，按照样品统计得出：柳沟和庙沟露天矿的细菌丰度和多样性较低，榆林垴钻井的细菌丰度和多样性较高。按照时间月统计得出：7月份细菌丰度高，1月份细菌丰度最低；7月多样性高，4月份多样性最低。这主要是因为pH为影响AMD中的细菌丰度和多样性的主要因素，测试结果表明pH越低，样品的细菌丰度和多样性越低，T越高样品的细菌丰度和多样性越高。
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图 6 样品α多样性的Chao1和Shannon指数曲线Figure 6. Chao1 and Shannon index curves of Alpha diversity of samplesα多样性随时间的变化特征主要以单个样品的月变化情况进行统计分析。此处利用Chao1指数和Shannon指数从生物群落的丰度和多样性研究生物多样性的变化特征。由图6可知，柳沟7月份细菌丰度最高，1月份细菌丰度最低；7月多样性高，1月份多样性最低，柳沟的细菌丰度和多样性受气温影响较大。庙沟露天矿7月份细菌丰度最高，11月份细菌丰度最低；7月份多样性高，2月份多样性最低。庙沟露天矿样品细菌丰度和多样性受降水影响较大。小沟露天矿7月份细菌丰度最高，2月份细菌丰度最低；1月份多样性高，3月份多样性最低。小沟露天矿细菌丰度和多样性受降水影响较大。榆林垴钻井11月份细菌丰度最高，4月份细菌丰度最低；6月份多样性高，4月份多样性最低。
2.2.2 AMD微生物群落分布特征
1)柳沟AMD主要菌属及丰度变化
在柳沟AMD的1～12月的样品中，平均相对丰度>2%的优势菌属的丰度变化如图7所示。可归类的菌属有Ferrovum、Ferritrophicum、Gallionella、Burkholderia- Caballeronia- Paraburkholderia、Acidibacillus、Bradyrhizobium。其中Ferrovum为嗜酸自养、有铁氧化能力的菌属[26]，适宜生活在酸性低温环境[27]。Gallionella为微需氧和化能自养属，利用分子氧把Fe2+氧化成Fe3+[28]。Ferritrophicum为微需氧和化能自养菌，可把Fe2+氧化成Fe3+[29-30]。Burkholderia- Caballeronia- Paraburkholderia广泛存在植物和动物的粪便内，常用于环境污染修复[31]。Acidibacillus广泛存在于酸性矿山水及含铁或硫的酸性环境中，能够将Fe2+氧化为Fe3+[32]。Thiomonas可促进 ${\mathrm{S}}_2{\mathrm{O}}_3^{2-} 、 {\mathrm{S}}_3{\mathrm{O}}_6^{2-}、{\mathrm{S}}_4{\mathrm{O}}_6^{2-}、{\mathrm{S}}_5{\mathrm{O}}_6^{2-}$和${\mathrm{S}}{\mathrm{O}}_3^{2-} $等转化为${\mathrm{SO}}_4^{2-} $[33]。Bradyrhizobium的主要作用是参与固氮[34]。
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图 7 柳沟AMD样品优势菌属及丰度变化Figure 7. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Liugou柳沟AMD的优势菌属为Ferrovum、Gallionella和Ferritrophicum，其2～12月份的相对丰度之和分别为65.46%、73.64%、62.04%、54.12%、35.65%、38.03%、65.85%、64.23%、76.45%、84.60%和81.80%，有9个月的丰度之和大于50%。其中，Ferrovum在2～5月的丰度维持在30%～45%，6～7月丰度下降到20%～25%； 8～10月份相对丰度又上升至54%～60%，12月份相对丰度维持在33.07%左右，其年内平均丰度为43.21%。在2～4月份Gallionella丰度维持在14%～30%， 5～10月份丰度下降至0.30%～3.79%， 11～12月份丰度又上升至13.82%～43.04%，其年内平均丰度为12.06%。Ferritrophicum在2～6月份相对丰度维持在3.85%～9.39%；7月份突然升高，相丰度值为17.04%；8～9月份又降低，相对丰度维持在3.99%～5.84%；10～11月份又升高，丰度维持在11.49%～16.08%；12月份又降低，丰度为5.69%。其年内平均丰度为8.54%。
2)庙沟露天矿AMD主要菌属及丰度变化
庙沟露天矿AMD检测的12个样品中，平均相对丰度>2%的优势菌属随时间变化的丰度如图8所示。可归类的菌属有Ferrovum、Gallionella、Acidithiobacillus、Leptospirillum、Ferrithrix、Acidiphilium、Metallibacterium、Sphingomonas、Acidibacillus和Sphingobium。庙沟露天矿AMD样品的优势菌属为Ferrovum、Gallionella和Acidithiobacillus，1～12月份优势菌属相对丰度之和分别为50.32%、84.81%、85.86%、58.02%、54.05%、42.64%、0.93%、62.70%、67.92%、70.51%、73.86%和53.39%。Ferrovum在1月份相对丰度为26.05%，2月份降至3.63%，3月份又升高到29.57%，在4～6月份相对丰度维持在41%～50%，7月相对丰度仅有0.65%，在8～11月份相对丰度维持在53%～70%，12月份降低为36.52%，其年内平均丰度为41.33%。Gallionella在1月份相对丰度为7.37%，2月份升至74.35%，3月份降至37.31%，4月又降至2.36%，在5～12月份相对丰度维持在0.05%～0.13%，其年内平均丰度为15.17%。Acidithiobacillus在1月份相对丰度为16.91%，2月份降低至6.83%，3月份升至18.98 %，在4月份相对丰度为13.26%，在5～8月份相对丰度维持在0.23%～0.41%，9月份又升至14.75%，10月份相对丰度为3.16%，在11～12月份相对丰度维持在16.30%～16.05%，其年内平均丰度为10.08%。
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图 8 庙沟露天矿AMD样品优势菌属及丰度变化Figure 8. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Miaogou open-pit mine3)小沟露天矿AMD主要菌属及丰度变化
在小沟露天矿AMD的1～12月的样品中，平均相对丰度>2%的优势菌属的丰度变化如图9所示。可归类的菌属有Pseudorhodobacter、unclassified_ f_Microbacteriaceae、Candidatus_Aquirestis、Porphyrobacter、norank_ f_Sporichthyaceae、uncultured_f_ Cryomorphaceae、Sideroxydans、 Sediminibacterium。其中Pseudorhodobacter为革兰氏阴性菌，好氧，最佳温度为20～25 ℃，pH 为6.0～7.5(最佳pH 7.0)广泛存在工业污水中[35]。Sideroxydans为革兰氏阴性，中性嗜酸菌的铁氧化细菌[36]。小沟露天矿AMD样品的优势菌属为 Pseudorhodobacter、unclassified_ f_Microbacteriaceae和Candidatus_ Aquirestis。样品1～12月份优势菌属相对丰度之和分别为30.17%、33.54%、 51.57%、46.17%、52.11%、32.70%、33.99%、49.74%、48.35%、20.33%、29.40%和32.44%。Pseudorhodobacter年内平均丰度为12.87%。unclassified_ f_Microbacteriaceae年内平均丰度为9.27%。Candidatus_ Aquirestis年内平均丰度为6.78%。
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图 9 小沟露天矿AMD样品优势菌属及丰度变化Figure 9. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Xiaogou open-pit mine4)榆林垴钻井AMD主要菌属及丰度变化
榆林垴钻井AMD的12个样品中，相对丰度>2%的优势菌属在随时间变化的丰度如图10所示。可归类的菌属有Ferrovum、unclassified_f__Enterobacteriaceae、Gallionella、unclassified_f_Yersiniace ae、Pseudomonas、Acinetobacter、Sphingomonas、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia和Pseudolabrys。Sphingomonas为非发酵革兰氏阴性，自养、兼性厌氧的嗜酸菌，在厌氧条件下能够还原铁、氧化硫。
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图 10 榆林垴钻井AMD样品优势菌属相对丰度变化Figure 10. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Yulinnao drilling榆林垴钻井AMD样品的优势菌属为Ferrovum、unclassified_f__Enterobacteriaceae和Gallionella。1～12月份3项相对丰度和分别为0.04%、22.18%、0.32%、47.31%、1.43%、0.10%、71.37%、0.32%、0.21%、0.30%、0.84%和0.42%。Ferrovum年内平均丰度为4.72%。 unclassified_f__Enterobacteriaceae年内平均丰度为4.14%。Gallionella年内平均丰度为3.21%.
2.3 AMD微生物群落分布与环境因子关联分析
根据山底河流域AMD的水化学特征，流域AMD具有pH低、Fe3+质量浓度高、Mn质量浓度高、${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度高的特点，因此AMD的T、pH、Fe3+质量浓度、Mn质量浓度和${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度为影响AMD微生物群落分布的主要环境因子。另外，氧化还原环境也是决定AMD酸性的主要因素，故选择缺氧或厌氧环境的AMD(榆林垴钻井)、缺氧环境的AMD(柳沟集中排泄点)、好氧环境的AMD(小沟露天矿和庙沟露天矿)进行环境因子(T、降水、pH、Fe3+质量浓度、Mn质量浓度、${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度和耗氧量（CODMn）)与AMD微生物群落的关联分析，露天矿中小沟露天矿原开采煤层为15号煤层、庙沟露天矿原开采煤层是12号煤层。
2.3.1 榆林垴钻井AMD微生物群落与环境因子关联分析
榆林垴钻井1～12月AMD的微生物群落与环境因子关联的CCA 分析如图11所示。根据环境因子箭头的长短可以判断环境因子和微生物群落相关系数。T、降水、pH、Fe3+质量浓度、Mn质量浓度、${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度和CODMn等环境因子与微生物群落的相关性从高到低的顺序为pH>降水> CODMn >${\mathrm{SO}}_4^{2-} $ 质量浓度>Mn质量浓度 >Fe3+质量浓度> T。相关系数分别为94.70%，88.44%，85.74%，77.58%，26.56%，23.92%和0.00%。1～12月AMD样本点之间的距离可以判断样品物种分布之间的相似性和差异性，由图可知榆林垴钻井AMD5月、6月、8月、9月、10月、11月和12月样品微生物群落相似性高，主要受Mn、降水和Fe3+影响。
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图 11 榆林垴钻井AMD样品微生物群落的CCA分析Figure 11. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Yulinnao drilling2.3.2 柳沟AMD微生物群落与环境因子关联分析
柳沟1～12月AMD的微生物群落与环境因子关联的CCA 分析如图12所示。环境因子与微生物群落的相关性从高到低的顺序为pH> ${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度> Mn质量浓度>CODMn >Fe3+质量浓度>T>降水，它们的相关系数分别为98.66%、97.53%、83.81%、63.41%、58.40%、55.32%和50.47%。由图12可知柳沟2～12月AMD样品的距离相近，表明它们的微生物群落相似，且影响微生物群落的主要是降水、T和Fe3+。
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图 12 柳沟AMD样品微生物群落的CCA分析Figure 12. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Liugou2.3.3 庙沟露天矿AMD微生物群落与环境因子关联分析
庙沟露天矿1～2月AMD的微生物群落与环境因子关联的CCA 分析如图13所示。环境因子与微生物群落的相关性从高到低的顺序为Mn质量浓度> ${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度> 降水>T >Fe3+质量浓度>CODMn>pH，相关系数分别为99.54%、86.01%、51.23%、49.61%、49.09%、34.52%和26.89%。由图13可知庙沟露天矿出露点5月、6月、8月、9月、10月、11月和12月的样品微生物群落相似性高。7月与2月差异性大，主要受CODMn和pH影响。
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图 13 庙沟露天矿AMD样品微生物群落的CCA分析Figure 13. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Miaogou open pit mine2.3.4 小沟AMD微生物群落与环境因子关联分析
小沟露天矿1～12月AMD样品中微生物群落分布的RDA分析如图14所示。环境因子与微生物群落的相关性从高到低的顺序为${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度>T>降水>Mn质量浓度> CODMn>pH>Fe3+质量浓度。相关系数分别为95.55%、94.55%、88.22%、84.00%、78.20%、74.35%和59.79%。由图14可知小沟露天矿出露点3月和4月样品微生物群落相似性高，主要受${\mathrm{SO}}_4^{2-} $影响；5月和6月样品微生物群落相似性高，主要受pH影响；2月和11月样品微生物群落相似性高，主要受Mn和Fe3+影响；12月和1月样品微生物群落相似性高，主要受Mn和${\mathrm{SO}}_4^{2-} $影响。
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图 14 小沟露天矿AMD样品微生物群落的RDA分析Figure 14. RDA analysis of microbial communities of AMD samples from Xiaogou open-pit mines3. 讨 论
3.1 AMD水化学特征及成因
AMD为由煤层和围岩中含有的硫化物、O2、H2O和微生物共同作用下发生氧化反应所形成的。一般认为酸性矿井水的形成是氧化亚铁硫杆菌、Fe3+和O2共同作用的结果[37]。AMD的pH往往在2～5，其${\mathrm{SO}}_4^{2-} $、TDS、Fe、Mn等含量高[38]。与未采煤影响的石炭二叠系的裂隙泉水化学指标相比较，AMD中的较高的${\mathrm{SO}}_4^{2-} $和Fe含量主要来源含煤地层中黄铁矿氧化，Al和Na主要来源于高岭石、钠长石等硅酸岩在酸性条件下的溶解；Ca、Mg离子则主要来源于围岩和煤中方解石、白云石的溶解，AMD水化学特征主要受pH和围岩水岩作用影响。Al、Fe、Mn等金属元素与pH负相关。AMD水样的pH与Eh具有明显的负相关关系，NAICKER[39]、赵峰华[40]和岳梅等[41]对AMD的研究也得出了同样的规律，该现象主要因为AMD中Fe随着pH增加而沉淀，因而Eh随之降低逐渐变为弱氧化环境。本研究得出好氧或缺氧环境下AMD的pH与降水、T、Eh呈负相关，与DO呈正相关；厌氧环境下AMD的pH与 Fe3+、Eh、降水呈负相关。好氧环境下AMD的 δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $较低，厌氧环境下AMD的 δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $较高，煤矿酸性矿井水的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $受δ34S–FeS2控制，不同水文地质条件下AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $也受煤矿酸性矿井水与围岩水岩作用的影响。
3.2 AMD的微生物群落多样性及其分布特征
AMD形成过程是铁硫元素的释放过程，是涉及溶浸、氧化和水解等一系列物理化学及生物化学过程[42-43]。其中，硫化矿物的氧化是AMD形成的关键[44-45]。微生物在AMD的形成过程中发挥重要作用[46-47]。不少学者对其周边的酸性矿井水微生物群落进行研究发现，pH<2环境下AMD中微生物群落的优势菌群为Acidithiobacillus[48-49]、ferrooxidans[50-51]。pH为决定AMD极端环境中微生物群落结构和多样性的主要因子[52]。AMD污染河流中影响微生物群落组成的因子包括pH、Fe、S、Mn和N等[53]。本研究显示山底河流域微生物群落受pH、T和降水的影响较大，AMD中微生物群落的优势菌群为Ferrovum和Gallionella。
4. 结 论
1)山底河流域AMD的水化学类型为SO4–Mg·Ca型、SO4–Mg型和SO4–Na型。阳离子特征为 Ca2+、Mg2+和Na+质量浓度高，K+质量浓度低，阴离子特征${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度高，Cl−质量浓度低。AMD中Ca、Mg离子则主要来源于围岩和煤中方解石、白云石的溶解；K、Na主要来源于长石等硅酸岩在酸性条件下的溶解；${\mathrm{SO}}_4^{2-} $、Fe含量主要来源于含煤地层中黄铁矿氧化。Fe2+含量是影响AMD耗氧量的主要因素，${\mathrm{SO}}_4^{2-} $为影响TDS含量的主要因素。
2)好氧或缺氧环境下AMD的pH与降水、T、Eh呈负相关，与DO呈正相关；厌氧环境下AMD的pH与 Fe3+、Eh、降水呈负相关。好氧环境下AMD的 δ34S–SO42–较低，厌氧环境下AMD的 δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $较高，煤矿酸性矿井水的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $受δ34S–FeS2控制，不同水文地质条件下AMD的δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $也受煤矿酸性矿井水与围岩水岩作用的影响。
3)山底河流域微生物群落受pH、T和降水的影响较大，Ferrovum和Gallionella为影响AMD水化学特征的优势菌属。柳沟AMD的微生物群落分布与降水、T和Fe3+相关性高。庙沟露天矿AMD的微生物群落分布与Mn、${\mathrm{SO}}_4^{2-} $相关性高。小沟露天矿的微生物群落分布与${\mathrm{SO}}_4^{2-} $、T相关性高。榆林垴的微生物群落分布与pH、降水相关性高。
致谢：感谢广西医科大学吴棘教授，阳文秀博士在数据归纳统计方面的指导。
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图 1 山底河流域水文地质图和采样点
Figure 1. Hydrogeological map and sampling sites of Shandi River Basin
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图 4 山底河流域AMD中 Ca2+与Mg2+关系
Figure 4. Relationship between Ca2+ and Mg2+ in AMD in Shanxi River Basin
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图 5 山底河流域${\mathrm{SO}}_4^{2-} $质量浓度和pH随δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $的变化
Figure 5. Changes of ${\mathrm{SO}}_4^{2-} $ and pH with δ34S–${\mathrm{SO}}_4^{2-} $ in Shanxi River Basin
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图 6 样品α多样性的Chao1和Shannon指数曲线
Figure 6. Chao1 and Shannon index curves of Alpha diversity of samples
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图 7 柳沟AMD样品优势菌属及丰度变化
Figure 7. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Liugou
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图 8 庙沟露天矿AMD样品优势菌属及丰度变化
Figure 8. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Miaogou open-pit mine
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图 9 小沟露天矿AMD样品优势菌属及丰度变化
Figure 9. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Xiaogou open-pit mine
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图 10 榆林垴钻井AMD样品优势菌属相对丰度变化
Figure 10. Changes of dominant genera and abundance of bacteria in AMD samples from Yulinnao drilling
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图 11 榆林垴钻井AMD样品微生物群落的CCA分析
Figure 11. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Yulinnao drilling
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图 12 柳沟AMD样品微生物群落的CCA分析
Figure 12. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Liugou
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图 13 庙沟露天矿AMD样品微生物群落的CCA分析
Figure 13. CCA analysis of microbial communities of AMD samples from Miaogou open pit mine
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图 14 小沟露天矿AMD样品微生物群落的RDA分析
Figure 14. RDA analysis of microbial communities of AMD samples from Xiaogou open-pit mines
表 1 山底河流域AMD取样点基本情况
Table 1 Basic situation of AMD sampling sites in Shandi River Basin
样品 样品数量(组) 监测点类别 采空区煤层 氧化还原环境 水位标高/m 裂隙水 3 石炭二叠裂隙水 未开采 935.0～1 002.5 AMD01 12 采空区矿井溢出点 15号 缺氧 827.8 AMD02 12 露天矿坑水 12号 好氧 857.6 AMD03 12 露天矿矿渣淋滤水 15号 好氧 875.4 AMD04 12 采空区矿井水 15号 厌氧或缺氧 863.1 
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